37個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)性作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:肝病是一類較常見的嚴(yán)重影響人類健康的疾病，若肝損傷長期得不到及時(shí)有效的治療，最終會(huì)進(jìn)展為肝癌或肝衰竭，顯著降低病人生存質(zhì)量并直接威脅生命。雖然不同的肝病發(fā)生機(jī)制各不相同，但有研究表明免疫系統(tǒng)在大多數(shù)發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。伴刀豆蛋白A(Con A)誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是一個(gè)較理想的T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎小鼠模型，用來模擬人病毒性和自身免疫性肝病。
　　36個(gè)氨基酸多肽片段是本室前期在尋找早期肝炎臨床診斷的生物標(biāo)志物時(shí)運(yùn)用基質(zhì)輔助激

2、光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)從慢性肝炎病人血清中檢測(cè)到的一個(gè)含量較高的多肽。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)該多肽高表達(dá)可改變體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的增殖周期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。
　　迄今為止，還沒有關(guān)于該多肽在肝炎動(dòng)物模型中生理和病理作用的研究，我們推測(cè)其可能在肝炎的進(jìn)展過程中發(fā)揮作用，故進(jìn)行本研究。本研究利用Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型研究該36個(gè)氨基酸多肽片段在免疫誘導(dǎo)的肝損傷中的作用，并初步探討其作用機(jī)制，為下

3、一步臨床肝病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1預(yù)防性給予小鼠人工合成的36個(gè)氨基酸多肽片段或地塞米松，一小時(shí)后注射ConA誘導(dǎo)肝損傷。ConA注射12小時(shí)后檢測(cè)各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，肝組織進(jìn)行石蠟包埋并作HE染色，觀察該多肽預(yù)防性給藥對(duì)Con A誘導(dǎo)肝損傷的影響。
　　2預(yù)防性給予小鼠人工合成的36個(gè)氨基酸多肽片段或地塞米松，一小時(shí)后給予致死劑量ConA，觀察各組小鼠

4、72小時(shí)內(nèi)的死亡情況，進(jìn)行生存分析，進(jìn)一步確定該多肽片段對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)性作用。
　　3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組小鼠肝細(xì)胞凋亡及有絲分裂情況，從肝細(xì)胞角度探討該多肽片段在Con A誘導(dǎo)肝損傷過程中的作用機(jī)制。
　　4 FCM檢測(cè)各組小鼠肝組織淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞）浸潤情況，探討該多肽片段在ConA誘導(dǎo)肝損傷免疫應(yīng)答方面的作用機(jī)制。
　　5通過尾靜脈注射Con A誘導(dǎo)肝損傷，0.5小時(shí)后給

5、予36個(gè)氨基酸多肽片段進(jìn)行治療，檢測(cè)ConA注射后12小時(shí)后各組血清ALT和AST水平，肝組織進(jìn)行石蠟包埋并作HE染色，觀察其對(duì)Con A誘導(dǎo)肝炎的治療作用。此外，用致死劑量ConA處理小鼠后，用多肽片段或地塞米松治療，觀察其72小時(shí)內(nèi)的死亡情況，做生存分析，進(jìn)一步確定該多肽片段對(duì)ConA所致肝損傷的治療效果。
　　結(jié)果:
　　136個(gè)氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對(duì)ConA誘導(dǎo)的肝損傷的影響
　　與模型組相比，各多肽片段及

6、地塞米松預(yù)防性給藥組均顯著降低血清ALT和AST水平(均P＜0.05)。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織出現(xiàn)典型肝壞死表現(xiàn)及淋巴細(xì)胞浸潤;多肽片段75μg/kg組肝細(xì)胞壞死明顯減少，其他劑量組(150μg/kg、300μg/kg和600μg/kg)以及地塞米松組均未見肝細(xì)胞壞死區(qū)域。
　　236個(gè)氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對(duì)致死劑量Con A導(dǎo)致的小鼠生存情況的影響
　　多肽片段和地塞米松預(yù)防性給藥組小鼠生存率分別為70％和8

7、0％，中位生存時(shí)間均為72小時(shí)，均顯著高于模型組（20％，11小時(shí)），可見多肽片段能有效降低小鼠的死亡率(均P=0.004)。
　　336個(gè)氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對(duì)肝細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　各多肽片段及地塞米松預(yù)防性給藥組小鼠凋亡肝細(xì)胞所占比例分別為14.73±3.37％，10.01±0.78％，6.41±0.98％，12.86±1.79％，8.4±2.01％，均顯著低于Con A模型組30.24±1.29％，P值均小于

8、0.01;隨著多肽片段劑量增大凋亡細(xì)胞所占比例呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)多肽片段達(dá)到600μg/kg時(shí)凋亡細(xì)胞所占比例出現(xiàn)上升。多肽片段600μg/kg組G0/G1期肝細(xì)胞所占比例顯著高于模型組，G2/M期和S期肝細(xì)胞所占比例顯著低于模型組(均P＜0.01);多肽片段75μg/kg、150μg/kg和300μg/kg組G2/M肝細(xì)胞所占比例均低于模型組（均P＜0.05）;地塞米松組G0/G1期肝細(xì)胞所占比例顯著高于模型組，G2/M期和S期肝細(xì)胞所

9、占比例顯著低于模型組(均P＜0.01)。
　　436個(gè)氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對(duì)肝組織淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量的影響
　　各多肽片段預(yù)防性給藥組小鼠肝組織浸潤T細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞比例與模型組相比無明顯差異，地塞米松組T細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例顯著低于模型組(均P＜0.01)。
　　536個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)ConA所引起的肝損傷的治療作用
　　多肽片段治療組和地塞米松治療組血清ALT和AST水平均顯著低于模型組(均P＜

10、0.01)，HE染色均未見明顯肝細(xì)胞壞死區(qū)域。對(duì)致死劑量ConA誘導(dǎo)的肝損傷，多肽片段治療后小鼠生存率和中位生存時(shí)間分別為50％和58小時(shí)，地塞米松治療后小鼠生存率和中位生存時(shí)間分別為60％和72小時(shí)，兩組的生存率和中位生存時(shí)間均顯著高于模型組（20％，13小時(shí)，P＜0.026，P＜0.011），說明治療性給藥也可提高小鼠生存率和中位生存時(shí)間。
　　結(jié)論:
　　1外源性給予36個(gè)氨基酸多肽片段可有效預(yù)防和治療ConA誘導(dǎo)的肝