16個氨基酸多肽片段對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　酒精、慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、肥胖、自身免疫性肝炎、代謝性疾病、藥物毒物和膽汁淤積等均可導(dǎo)致肝纖維化，幾乎所有的慢性肝病都與纖維化相關(guān)，而且易進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭、肝癌。進(jìn)展性的肝纖維化尚且可逆轉(zhuǎn)，肝硬化則基本不可逆。四氯化碳（Carbon tetrachloride， CCl4）誘導(dǎo)的小鼠慢性肝損傷模型已較成熟，可用來模擬人類眾多慢性肝臟疾病的共同病理過程—肝纖維化。經(jīng) CCl4長期刺激可致小鼠肝細(xì)胞壞死、炎癥、

2、纖維組織增生，伴隨血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ aspartate aminotransferase, AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransaminase, ALT）升高，并且有大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞外基質(zhì)大量膠原沉積。
　　為尋找早期肝炎臨床診斷的生物標(biāo)志物，本室前期運用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）從慢性肝炎病人血清中檢測到一個差異性表達(dá)的多肽，即16個氨基酸多肽片段，并通過體外

3、實驗證實該多肽有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用。
　　本室前期研究成果已證實該多肽針對免疫性肝炎肝損傷及脂肪肝具有保護作用，推測其可能在慢性肝臟疾病中發(fā)揮同樣的保護作用，故進(jìn)行本研究。本研究利用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型研究16個氨基酸多肽片段在肝纖維化中的治療作用，并對其機制初步探究，為進(jìn)一步臨床肝病治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　116個氨基酸多肽片段對肝纖維化小鼠的保護作用
　　50只雄性，6-8周齡balb

4、/c小鼠隨機分為五組，分別為正常組，模型組，秋水仙堿組，16個氨基酸多肽低劑量組（400μg/kg），高劑量組（800μg/kg），每組10只。除正常組在相應(yīng)給藥時點腹腔注射生理鹽水（1ml/kg）外，其余各組均分別通過腹腔注射給予25％CCl4溶液（1.5μl/g），每3天1次，共10次。同時，在第三次注射CCl4之后，除正常組、模型組分別在相應(yīng)給藥時點通過尾靜脈注射給予生理鹽水外，其余各組分別經(jīng)尾靜脈注射給予400、800μg/kg

5、體重多肽，每3天1次，持續(xù)7次或經(jīng)灌胃給予秋水仙堿（200μg/kg），每周五天，持續(xù)3周后，眼球取血，收集小鼠血液，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）水平；ELISA試劑盒測定血清透明質(zhì)酸酶（Hyaluronic Acid，HA）、四型膠原（Collagen TypeⅣ，Ⅳ-C）水平。通過血清學(xué)指標(biāo)觀察16個氨基酸多肽片段對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的影響。<

6、br>　　2肝組織病理學(xué)檢測
　　眼球取血后處死小鼠，剝離肝臟，分別切取肝臟左葉、右葉相同位置合適大小的兩塊肝組織（一般厚度不超過0.5厘米）制成組織蠟塊，行5μm連續(xù)切片后分別進(jìn)行 HE染色、Masson染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)及膠原沉積情況，并采集圖像。
　　3小鼠肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平的測定
　　自NCBI中獲取小鼠源Ⅰ型膠原（Collagen, typeⅠ, alpha1,Col1a1）、Ⅲ型

7、膠原（ Collagen, typeⅢ, alpha1,Col3a1）、金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase, TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMP-2）、結(jié)締組織生長因子（Connective Tissue Growth Factor, CTGF）的基因序列,設(shè)計并合成引物（上海生工生物工程有限公司）。提取小鼠肝組織總R

8、NA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，分別以10倍稀釋的Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF、GAPDH cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴增曲線和融解曲線，記錄基因相對表達(dá)量RQ值進(jìn)一步分析。探討16個氨基酸多肽片段對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的相關(guān)作用機制。
　　4肝細(xì)胞內(nèi)活性氧的測定
　　采用流式細(xì)胞術(shù)，對各組肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species, ROS）

9、含量進(jìn)行檢測，了解氧化應(yīng)激水平。
　　結(jié)果：
　　1各組小鼠血清肝功能及肝纖維化變化情況
　　16個氨基酸多肽片段低劑量組（36.85±3.36，71.03±7.42）、高劑量組（35.27±4.34，73.03±8.13）、秋水仙堿組（34.65±5.57，69.49±11.76）及正常組（31.05±2.91，62.02±9.46）血清 ALT、AST水平均低于模型組（45.07±5.32，85.48±3.44）（

10、P＜0.05）；各組血清ALP水平均無差異（P＞0.05）；模型組（286.95±37.82）血清HA水平較正常組（229.15±32.43）升高（P＜0.05），其他各組較模型組有所降低，但并無差異；16個氨基酸多肽片段低劑量組、高劑量組及正常組血清Ⅳ-C水平（129.68±29.87，109.26±30.16，79.10±30.33）均低于模型組（180.96±40.73）（P＜0.05），秋水仙堿組（157.12±32.26）較模

11、型組有所降低，但并無差異（P＞0.05），16個氨基酸多肽片段低劑量組、高劑量組血清Ⅳ-C水平均低于秋水仙堿組（P＜0.05）。
　　2肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果
　　HE結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞雜亂無章，中央靜脈和門管區(qū)有纖維組織生成，并伴有大量炎細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)大片肝細(xì)胞壞死區(qū)域；秋水仙堿陽性對照組有效改善肝細(xì)胞壞死情況，炎細(xì)胞浸潤減少；16個氨基酸多肽片段兩個劑量組均未見明顯壞死及炎細(xì)胞浸潤。
　　Masson染色模型

12、組中央靜脈、匯管區(qū)可見大量綠色膠原纖維，肝小葉被寬窄不一的纖維間隔分割成假小葉；秋水仙堿陽性對照組肝纖維化程度降低，僅見少量纖維組織；16個氨基酸多肽片段兩個劑量組與模型組相比纖維組織顯著減少。
　　3各組小鼠肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平變化
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示，16個氨基酸多肽片段低劑量組（7.18±1.61，3.44±1.73，4.37±1.56，3.39±3.19，1.45±0.77）、高劑量組（5.66±2.07

13、，3.77±2.64，3.43±1.42，3.43±2.92，1.68±1.21）、秋水仙堿組（9.60±0.52，5.58±0.65，3.97±4.01，5.93±4.84，1.91±1.03）及正常組（1.00）肝組織 Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF各基因表達(dá)水平均低于模型組（20.67±6.60，12.61±1.35，8.25±1.77，11.93±6.82，3.97±1.90）（P＜0.05）。<

14、br>　　4各組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平變化情況
　　16個氨基酸多肽片段低劑量組（431.83±174.80）、高劑量組（404.50±199.43）、秋水仙堿組（523.00±218.61）及正常組（220.33±62.69）ROS水平均低于模型組（859.63±337.81）（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　116個氨基酸多肽片段可顯著改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。
　　216個氨基酸多肽片段減