36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的保護(hù)性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是一種慢性進(jìn)展性疾病，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)的形成和過度沉積，這些過程可使肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。肝纖維化是多種慢性肝臟疾?。稍谠缙陔A段被逆轉(zhuǎn)）發(fā)生進(jìn)展的最終共同通路，當(dāng)肝纖維化嚴(yán)重到不可逆轉(zhuǎn)階段，患者發(fā)展為肝硬化和肝癌的危險(xiǎn)性增加。因此對(duì)纖維化的早期發(fā)現(xiàn)和治療至關(guān)重要。目前，雖然在該病的診斷和治療方面取得了一些進(jìn)步，但仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)治療方案和特效治療藥物。
　　36個(gè)氨基酸多肽片段是本研究室在尋找用于肝炎診斷的生物

2、學(xué)標(biāo)志物時(shí)從慢性肝炎病人血清中檢測(cè)到的，其含量較高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)此36個(gè)氨基酸多肽片段可改變肝細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡。
　　目前尚無此36個(gè)氨基酸多肽片段在肝纖維化小鼠模型中生理和病理作用的研究。本研究室前期發(fā)現(xiàn)36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)急性肝損傷和非酒精性脂肪肝都具有保護(hù)性作用，為探討該多肽片段是否對(duì)肝纖維化也具有類似的作用，故進(jìn)行本項(xiàng)研究。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射四氯化碳的方法，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝纖維化，以研究36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)該模型小鼠

3、的保護(hù)性作用，并探索其發(fā)揮作用的靶點(diǎn)和通路，為肝纖維化的治療提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和研究方向。
　　方法：
　　1、36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)纖維化小鼠的保護(hù)作用
　　將50只Balb/c雄性小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組、陽性藥物組、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組(150μg/kg)和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑量組(250μg/kg)。正常組通過尾靜脈分別在相應(yīng)給藥時(shí)點(diǎn)給予注射生理鹽水；模型組腹腔注射25％CCl4，每3天1次

4、，共10次。自第4次腹腔注射CCl4后，后一天開始給予尾靜脈注射生理鹽水進(jìn)行治療，共7次；陽性藥物組造模后，給予秋水仙堿灌胃治療，5次/周；兩個(gè)多肽片段治療組造模后尾靜脈注射36個(gè)氨基酸多肽片段進(jìn)行治療，共7次。最后一次注射治療藥物后處死小鼠并分離血清，分別檢測(cè)各組小鼠血清ALT、AST、HA、Ⅳ-C水平，從血清學(xué)水平觀察36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)肝功能及纖維化程度的保護(hù)性作用。
　　2、肝組織病理學(xué)檢測(cè)
　　對(duì)各組肝組織進(jìn)行病

5、理學(xué)檢測(cè)（HE染色和Masson染色），觀察其病理形態(tài)學(xué)改變和膠原纖維沉積情況，評(píng)價(jià)36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)肝組織的保護(hù)作用。
　　3、肝纖維化發(fā)展過程中相關(guān)基因表達(dá)水平
　　提取肝組織總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測(cè)定Col1A1、Col3A1、MMP-2、TIMP-1和CTGF的表達(dá)情況，分析36個(gè)氨基酸多肽片段對(duì)各組小鼠的影響情況。
　　4、肝細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測(cè)
　　采用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)各組肝細(xì)胞內(nèi)活性

6、氧（ROS）含量進(jìn)行檢測(cè)，了解氧化應(yīng)激水平。
　　結(jié)果：
　　1、各組小鼠血清酶（ALT、AST）結(jié)果
　　與正常組（31.05±2.91）相比，模型組血清ALT（45.07±5.32）水平均升高（P<0.01）；與模型組相比，秋水仙堿組（34.65±5.57）、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組（36.08±2.07）、高劑量組（40.08±2.84）血清ALT水平均低于模型組（P<0.05）。模型組血清AST（85.48

7、±3.44）與正常組（62.05±10.93）相比，其水平升高（P<0.01）；秋水仙堿組（73.64±11.76）和36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組（71.89±11.02）AST水平低于模型組（P<0.05）。
　　2、各組小鼠纖維化指標(biāo)（HA、Ⅳ-C）結(jié)果
　　模型組小鼠血清HA（291.98±39.16）比正常組（229.15±32.43）升高（P<0.05），36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組（240.23±25.75）血清

8、HA水平降低（P<0.05）。與正常組（79.10±30.33）相比，模型組Ⅳ-C（180.95±40.73）升高（P<0.01），36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組（104.55±31.77）和高劑量組（117.46±26.92）血清IV-C水平降低，與模型組具有差異（P<0.01）。
　　3、各組小鼠肝臟病理學(xué)變化情況
　　HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊形成肝索，無壞死區(qū)域；模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大面

9、積壞死，正常結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；秋水仙堿組、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑量組壞死面積大大減少，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中低劑量組幾乎未見壞死區(qū)域。
　　Masson染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織內(nèi)無膠原沉積，胞漿呈紅色，染色均勻；模型組小鼠肝組織正常小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)大量異常沉積的膠原，出現(xiàn)假小葉；秋水仙堿組纖維含量減少，假小葉結(jié)構(gòu)不明顯；36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑

10、量組纖維異常沉積明顯減少，無假小葉出現(xiàn)。
　　4、各組小鼠肝纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平變化
　　各組Col1A1的相對(duì)表達(dá)量為：1.00，20.67±6.60，9.60±0.52，11.10±4.17，10.47±5.78（P<0.05）；Col3A1相對(duì)表達(dá)量為1.00，12.61±1.35，5.58±0.65，6.16±3.23和6.57±1.07（P<0.05）；MMP-2相對(duì)表達(dá)量為1.00，11.93±3.62

11、，5.93±2.84，5.26±1.78和5.67±2.46（P<0.05）；TIMP-1相對(duì)表達(dá)量為1.00，8.25±1.87，3.97±1.02，3.36±1.83，4.19±2.78（P<0.05）；CTGF相對(duì)表達(dá)量：1.00，3.97±2.12，1.91±1.03，1.74±0.88，2.22±1.39（P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組Col1A1、Col3A1、MMP-2、TIMP-1和CTGF相對(duì)表達(dá)量均

12、升高（P<0.05）。與模型組相比，秋水仙堿組、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑量組Col1A1mRNA水平均下降（P<0.05）；秋水仙堿組、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑量組Col3A1水平降低（P<0.05）；秋水仙堿組、36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組和36個(gè)氨基酸多肽片段高劑量組MMP-2水平下降（均P<0.05）；秋水仙堿組和36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組TIMP-1水平降低（P<0.

13、05）；秋水仙堿組和36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組CTGF水平降低（P<0.05）。
　　5、各組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平
　　模型組（859.63±337.81）細(xì)胞內(nèi)ROS水平與正常組（220.33±62.69）相比高于（P<0.01）；與模型組相比，36個(gè)氨基酸多肽片段低劑量組（259.60±118.10）和高劑量組（327.20±123.63）ROS水平下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論