羅格列酮對APAP急性肝損傷的保護作用及機制.pdf

1、背景與目的：
　　藥物性肝損傷（drug induced liver injury,DILI）嚴(yán)重威脅患者用藥后的生命安全。對乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）是臨床常用的消炎鎮(zhèn)痛藥物，在過量使用時可引起急性肝衰竭甚至死亡。APAP造成肝損傷的機制可能有炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機制。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated r

2、eceptors，PPARγ)具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等生理功能，對多種因素引起的肝損傷具有保護作用。噻唑烷二酮類藥物(troglitazone, TZDs)是PPARγ的配體，可以與PPARγ結(jié)合并激活PPARγ信號通路。已有多篇文獻報道，PPARγ激動劑羅格列酮（Rosiglitazone，RSG）具有抗炎及抗氧化應(yīng)激的作用，但RSG是否可以減輕APAP急性肝損傷時的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)尚不清楚。
　　本研究擬在建立A

3、PAP誘導(dǎo)急性肝損傷動物模型的基礎(chǔ)上，觀察RSG對APAP誘導(dǎo)急性肝損傷的保護作用，并從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激機制方面初步探討RSG對APAP急性肝損傷保護作用的機理。
　　方法：
　　1.為觀察RSG對APAP急性肝損傷的保護作用，隨機將健康雄性CD-1小鼠分成10組，每組6只，共60只。正常對照組：正常飼養(yǎng)，在APAP組給藥的同時用生理鹽水腹腔注射；單純 RSG組：在 APAP組給藥前48h、24h及1h分別予以RSG（20

4、mg/kg）灌胃，在APAP組給藥的同時給予等容積的生理鹽水腹腔內(nèi)注射；APAP組（4組，分別為APAP0h組、APAP1h組、APAP4h組及APAP24h組）：單次給予APAP（300mg/Kg）腹腔注射；RSG+APAP組（4組，即RSG+APAP0h組、RSG+APA P1h組、RSG+APAP4h組及RSG+APAP24h組）：在腹腔注射APAP前48 h、24h和1h予以RSG（20mg/kg）各灌胃一次。APAP組及RSG

5、+APAP組分別在APAP給藥后0h、1h、4h、24h剖殺小鼠。所有小鼠在APAP給藥前禁食12 h。收集血清檢測ALT、AST、CRP和TBIL水平；部分肝臟組織行HE病理檢查及凋亡檢測。
　　2.為研究RSG對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠生存率的影響，隨機將小鼠分為兩組，每組10只。APAP組及RSG+APAP組處理方法同方法1。觀察兩組小鼠在1周內(nèi)每天的生存?zhèn)€數(shù)，繪制生存曲線。
　　3.為觀察RSG對APAPⅠ相代謝

6、酶CYP2E1的影響，隨機將小鼠分成4組，每組6只，即正常對照組、RSG組、APAP組、RSG+APAP組，處理方法同方法1，在APAP處理后0.5h剖殺各組小鼠，取肝臟組織用Western blotting法檢測CYP2E1的表達。
　　4.為觀察RSG對APAP急性肝損傷的肝臟組織GSH代謝酶活性的影響，隨機將小鼠分成4組，每組6只，共24只，即正常對照組、RSG組、APAP組、RSG+APAP組，處理方法同方法1，在APAP

7、給藥后1h剖殺各組小鼠，取新鮮肝組織檢測谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GSH-Rd）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的酶活性。
　　結(jié)果：
　　1．RSG對APAP急性肝損傷的保護作用
　　從APAP給藥后1h開始，血清ALT、AST水平即進行性升高。血清T

8、BIL水平從APAP處理后4h開始進行性升高。RSG預(yù)處理后，血清ALT、AST及TBIL水平較同時段單純APAP組有不同程度的降低。
　　HE染色結(jié)果顯示，在APAP1h組，肝臟開始出現(xiàn)淤血水腫；APAP4h組有明顯的肝細(xì)胞點狀壞死、橋接壞死及亞大塊壞死；在APAP24h組出現(xiàn)明顯的大塊狀壞死。用TUNEL技術(shù)檢查發(fā)現(xiàn)，在APAP1h組，可見有少許肝胞凋亡；APAP4h組，其凋亡陽性細(xì)胞數(shù)則明顯增加，在24h達到最高峰。RSG預(yù)

9、處理的APAP組，肝細(xì)胞的變性、壞死程度及壞死面積均較同時段單純APAP組輕，且凋亡陽性細(xì)胞數(shù)也明顯低于同時段單純APAP組。
　　2．RSG對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠生存率的影響
　　單純APAP組小鼠7日生存率為50%，明顯低于RSG預(yù)處理組（80%）。
　　3．RSG對APAPⅠ相代謝酶CYP2E1的代謝的影響
　　APAP急性肝損傷時CYP2E1的表達并未發(fā)生明顯變化，RSG也不影響急性APAP急性肝

10、損傷時的CYP2E1的表達。
　　4．RSG對APAP急性肝損傷炎癥反應(yīng)的影響
　　4.1.RSG對APAP急性肝損傷模型的血清C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）的影響
　　與對照組相比，APAP組在4h后血清CRP表達開始輕度升高，在24h達高峰；用RSG預(yù)處理可以降低APAP造成的CRP升高水平。
　　4.2.RSG對APAP急性肝損傷時有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-act

11、ivated protein kinase，MAPK）信號通路的影響
　　用Western-blotting技術(shù)，對MAPK亞家族成員JNK、ERK1/2、P38MAPK及AKT的磷酸化水平進行觀察。結(jié)果提示，APAP急性肝損傷過程中，上述4種MAPK家族分子均被磷酸化激活。而使用RSG預(yù)處理，可以明顯下調(diào)APAP誘導(dǎo)的上述分子的磷酸化水平。
　　4.3.RSG對APAP急性肝損傷時NF-κB的信號通路的影響
　　用W

12、estern blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在APAP給藥后1h，細(xì)胞核內(nèi)的P65和P50表達增加，并且進行性升高至24h。表明NF-κB在APAP給藥后早期即被激活。使用RSG預(yù)處理，可以明顯下調(diào)NF-κB的核表達。
　　4.4.RSG對APAP急性肝損傷時炎性相關(guān)因子表達的影響
　　用RT-PCR的方法觀察RSG對APAP急性肝損傷時TNFα、KC、COX-2等炎性因子或趨化因子表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，APA

13、P組在出現(xiàn)肝損傷時，細(xì)胞因子TNFα、KC的mRNA水平明顯增加，而RSG預(yù)處理的APAP組，TNFα、KC的mRNA水平明顯低于同時段的APAP組。而各組COX-2的轉(zhuǎn)錄情況并沒有明顯差別。
　　5． RSG對APAP誘導(dǎo)肝損傷氧化應(yīng)激通路的影響
　　5.1.RSG可以減輕APAP導(dǎo)致的還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)耗竭
　　在APAP1h組，其肝臟組織中的GSH處于耗竭狀態(tài)；在APAP4h組，其

14、肝組織中GSH含量較APAP1h組有所上升；在APAP24h組，GSH幾乎恢復(fù)至對照組水平。在RSG+APAP1h組，GSH水平明顯高于單純APAP組；而在RSG+APAP4h及RSG+APAP24h組，其肝臟GSH含量與正常對照組無明顯差別。
　　5.2.RSG對APAP急性肝損傷的肝臟組織GSH代謝酶活性的影響
　　APAP過量可導(dǎo)致GST、GSH-Rd、GSH-Px三種代謝酶活性降低，RSG可以改善由APAP造成的GS

15、H-Rd的活性減低，對于GST及GSH-Px活降低也有一定的恢復(fù)作用，但無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.3.RSG對APAP急性肝損傷脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物表達的影響
　　將肝臟組織進行勻漿后，測定丙二醛（malonaldehyde,MDA）含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在APAP肝損傷早期（1h）即有MDA含量的明顯升高；而在4h后MDA含量及正常組無明顯的變化，而使用RSG預(yù)處理組各時段其MDA含量均未見明顯升高。
　　5.4.RSG對A

16、PAP急性肝損傷肝臟組織3硝基酪氨酸（3NT）的影響
　　采用Western blotting技術(shù)檢測提示，從APAP給藥后1h開始，3NT的表達呈進行性增加。而RSG預(yù)處理可以明顯降低APAP急性肝損傷組織的3NT表達。
　　5.5.RSG對APAP急性肝損傷肝臟組織NADPH氧化酶（NADPH xidase，NOX）表達的影響
　　用Western blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，從APAP給藥后1h開始，NOX-2