基于NF-κB信號通路研究熊果酸對MDR1 mRNA和P-gp表達的影響及其機制.pdf

1、背景：
　　熊果酸（UA）具有多種藥理活性及廣闊的應(yīng)用前景，但其口服生物利用度極低導(dǎo)致在臨床應(yīng)用上受到限制。業(yè)已證實，P-gp的外排效應(yīng)是引起UA口服生物利用度低的主要原因；而隨著UA濃度的增高，UA對P-gp外排活性的影響由抑制轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)的研究結(jié)果卻令人倍感困惑。雖然UA通過抑制NF-κB信號通路的活性而發(fā)揮抗炎﹑抗病毒作用的研究早有報告；但UA對P-gp外排效應(yīng)的影響究竟是抑制還是誘導(dǎo)，UA是否通過NF-κB信號通路而上下調(diào)控著

2、MDR1 mRNA和P-gp的表達，從而最終影響P-gp功能等疑惑至今尚未見國內(nèi)外相關(guān)的研究報道，確應(yīng)引起我們的密切關(guān)注和深入探究。因此，本課題基于NF-κB信號通路，從分子學(xué)水平探明UA對P-gp表達的調(diào)控機制，可為五環(huán)三萜類化合物轉(zhuǎn)運研究提供堅實的試驗和理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過建立穩(wěn)定及高表達MDR1 mRNA和P-gp的K562/ADR細胞模型，系統(tǒng)研究UA對MDR1 mRNA及P-gp表達的影響；基于NF-κ

3、B信號通路的NF-κB位點P65，深入地探討UA作用于MDR1 mRNA和P-gp的分子學(xué)機制。
　　方法：
　　1.以逐漸增大阿霉素濃度的方式誘導(dǎo)K562/ADR細胞的耐藥性，并最終以1.0μg/ml阿霉素維持細胞的耐藥性，按常規(guī)方法培養(yǎng)K562/ADR細胞，實驗前2周停藥，進行脫藥培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況，繪制細胞生長曲線。
　　2.采用MTS法檢測阿霉素、PDTC和UA對K562/ADR細胞的體外毒性作用，選取細胞

4、存活率高于80％的條件進行后續(xù)實驗。
　　3.以不同濃度NF-κB促進劑阿霉素或NF-κB特異性抑制劑PDTC為探針平行對照實驗，單獨或聯(lián)合作用于K562/ADR細胞模型48h后，運用RT-PCR、Western blotting等分子生物學(xué)方法檢測MDR1 mRNA和P-gp表達水平的變化，評價K562/ADR細胞模型MDR1 mRNA和P-gp的表達情況，以期為后續(xù)UA的研究建立穩(wěn)定且可靠的細胞模型。
　　4.將不同濃度

5、UA單獨或聯(lián)合5μM阿霉素作用于K562/ADR細胞模型48h后，采用RT-PCR、Western blotting等分子生物學(xué)方法檢測MDR1 mRNA和P-gp表達水平的變化，評價UA對K562/ADR細胞MDR1 mRNA和P-gp表達的影響。
　　5.基于NF-κB信號通路，將不同濃度UA﹑PDTC單獨或聯(lián)合5μM阿霉素作用于K562/ADR細胞模型48h后，提取細胞中的胞核蛋白，采用Western blotting免疫印

6、跡法檢測胞核蛋白P65表達水平的變化；深入探究UA對調(diào)控MDR1 mRNA和P-gp表達的上游調(diào)控位點NF-κB P65表達的影響。
　　6.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析：各個實驗組的數(shù)據(jù)都以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差齊性檢驗﹑單因素方差分析（One-way ANOVA）及相關(guān)分析，各組之間的比較采用LSD法；結(jié)果以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　

7、　結(jié)果：
　　1. NF-κB促進劑0.5~15μM阿霉素作用于K562/ADR細胞48h后，MDR1 mRNA的表達分別上調(diào)了14.26%、31.58%、39.32%、46.9%﹑62.37%；P-gp的表達分別上調(diào)了12.41%﹑22.63%﹑34.31%﹑43.8%﹑57.66%；0.5~15μM阿霉素能明顯上調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在0.5~15μM濃度范圍內(nèi)，阿霉素對MD

8、R1 mRNA和P-gp表達的促進作用均隨濃度的增加而增強（R2=0.8110；R2=0.8901）。
　　2.特異性抑制劑5~100μM PDTC作用于K562/ADR細胞48h后，MDR1 mRNA的表達分別下調(diào)了16.81%、32.74%、43.36%﹑54.87%﹑66.37%；P-gp的表達分別下調(diào)了29.02%﹑45.85%﹑64.51%﹑74.61%﹑82.12%；5~100μM PDTC能明顯下調(diào)MDR1 mRNA

9、和P-gp的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在5~100μM濃度范圍內(nèi)，PDTC對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制作用均隨濃度的增加而增強（R2=0.7708；R2=0.6583）。
　　3.當(dāng)5μM阿霉素時，抑制劑PDTC濃度為5~50μM作用于K562/ADR細胞48h后，25μM PDTC和50μM PDTC分別使MDR1 mRNA的表達下調(diào)了26.60%﹑48.94%；P-gp的表達下調(diào)了35.73%﹑48

10、.7%；25μM、50μM PDTC可明顯下調(diào)阿霉素誘導(dǎo)的MDR1 mRNA和P-gp的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.與空白組相比，5~50μM UA作用于K562/ADR細胞48h后，MDR1 mRNA的表達分別下調(diào)了9.04%﹑15.58%、28.75%﹑44.21%；P-gp的表達分別下調(diào)了23.36%、37.23%、43.07%﹑64.23%；10~50μM UA明顯下調(diào)MDR1 mRNA的表達，5~

11、50μM UA明顯下調(diào)P-gp的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在5~50μM濃度范圍內(nèi)，UA對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制作用均隨濃度的增加而增強（R2=0.9636；R2=0.8310）。
　　5.在促進劑5μM阿霉素存在下，5~50μM濃度的UA作用于K562/ADR細胞48h后，10μM UA﹑25μM UA和50μM UA分別使MDR1 mRNA的表達下調(diào)了24.06%﹑28.72%﹑34.53%；P

12、-gp的表達下調(diào)了20.96%﹑24.36%﹑31.2%；5~50μM UA能明顯抑制阿霉素誘導(dǎo)的MDR1 mRNA和P-gp的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.針對MDR1 mRNA/P-gp調(diào)控研究表明，5~50μM UA作用于K562/ADR細胞48h后，其上游調(diào)控核蛋白P65表達分別下調(diào)了13.73%﹑28.92%﹑44.07%﹑56.77%，而特異性抑制劑PDTC在5~100μM濃度范圍內(nèi)，P65的表達

13、分別下調(diào)了23.66%﹑39.8%﹑53.76%﹑65.59%﹑80.65%；且對P65表達的抑制作用均隨UA和PDTC濃度的增加而增強（R2=0.8924，R2=0.7548）。
　　7.在促進劑5μM阿霉素存在下，5~50μM濃度 UA和PDTC作用于K562/ADR細胞48h后，10μM UA﹑25μM UA和50μM UA使核蛋白P65的表達分別下調(diào)了32.62%﹑36.9%﹑45.45%，25μM PDTC和50μM P

14、DTC分別使P65的表達下調(diào)了42.86%﹑56.98%；UA和PDTC在相同的線性范圍內(nèi)5~50μM均能明顯抑制阿霉素誘導(dǎo)的P65的表達。
　　結(jié)論：
　　1.本研究建立的K562/ADR細胞模型能穩(wěn)定特異性高表達MDR1 mRNA及P-gp，可為基于NF-κB P65位點研究UA對MDR1 mRNA及P-gp表達的影響提供適宜且可靠的細胞模型。
　　2. UA在基因和蛋白水平上明顯抑制K562/ADR細胞模型中MD

15、R1 mRNA和P-gp的表達，與NF-κB通路激活的特異性抑制劑PDTC作用相似，且對抗促進劑阿霉素的誘導(dǎo)作用，提示其抑制效應(yīng)機制可能為UA抑制了NF-κB信號通路的活性。
　　3. UA明顯抑制K562/ADR細胞模型中MDR1 mRNA和P-gp的上游調(diào)控信號通路NF-κB位點核蛋白P65的表達；有促進劑阿霉素存在時，仍與作用于NF-κB位點P65的抑制劑PDTC抑制效應(yīng)相同，提示UA對MDR1 mRNA和P-gp表達的抑制