熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)總共分為三部分，實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱搜芯啃芄釋?duì)大鼠靜脈再狹窄的影響及機(jī)制，同時(shí)研究Cuff套管技術(shù)在大鼠靜脈再狹窄模型中的應(yīng)用。
　　(1)兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對(duì)比研究:利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈。建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型。將兩種模型建立過(guò)程和靜脈橋內(nèi)膜和中膜的狹窄情況進(jìn)行對(duì)比研究。研究?jī)煞N動(dòng)物模型在模型建立過(guò)程及建立后靜脈橋狹窄情況的異同。
　　

2、(2)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管橋增生狹窄的實(shí)驗(yàn)研究:將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動(dòng)脈，建立大鼠靜脈橋再狹窄的動(dòng)物模型。設(shè)立對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠給予兩種不同劑量的熊果酸，研究不同劑量的熊果酸對(duì)靜脈橋不同時(shí)期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用，細(xì)胞增生及凋亡的影響。
　　(3)熊果酸在大鼠自體靜脈移植再狹窄模型中抑制血管炎癥的實(shí)驗(yàn)研究:將大鼠的頸外靜脈用Cuff吻合法移植至頸總動(dòng)脈，建立大鼠靜脈橋再狹窄的動(dòng)物模型

3、。予以熊果酸抑制NF-κB的活化，檢測(cè)靜脈橋炎癥反應(yīng)過(guò)程中MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的變化，研究熊果酸抑制靜脈再狹窄作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)將30只大鼠隨機(jī)分成A、B共2組，每組15只。術(shù)前對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠禁食8小時(shí)，禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，A組將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈，B組移植至腹主動(dòng)脈，分別建成兩種自體靜脈再狹窄的動(dòng)物模型。術(shù)后滿第1周、第2

4、周和第4周分三次取材，每次隨機(jī)選取5只大鼠。麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。取下后用生理鹽水沖洗，4％多聚甲醛沖洗固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度為4μm。隨機(jī)選取5個(gè)不同位置的切片做HE染色，計(jì)算內(nèi)膜、中膜厚度。
　　(2)將45只大鼠隨機(jī)分成A、B、C共3組，每組15只。術(shù)前對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠禁食8小時(shí)，禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈。A

5、組為對(duì)照組，在靜脈移植至頸總動(dòng)脈后不予藥物干預(yù)，B組術(shù)后第一天開始予以15mg/(kg·d)熊果酸灌胃，C組術(shù)后第一天開始予以30mg/(kg·d)熊果酸灌胃。在術(shù)后滿第1周、第2周和第4周分三次取出靜脈橋標(biāo)本，每次每組隨機(jī)選取5只大鼠，麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。切片厚度為4μm。對(duì)靜脈橋切片行HE染色、Masson染色、PCNA染色、TUNEL檢測(cè)。研究不同劑量的熊果酸對(duì)靜脈橋不同時(shí)期內(nèi)膜、中膜增生的抑制作用

6、，細(xì)胞增生及凋亡的影響。
　　(3)將45只大鼠隨機(jī)分成A、B、C共3組，每組各15只。A組為對(duì)照組，不作任何處理。B組為模型組，將頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈后不予藥物干預(yù)。C組為熊果酸組，將右側(cè)頸外靜脈移植至頸總動(dòng)脈后術(shù)后當(dāng)天開始予以30mg/(kg·d)熊果酸灌胃。B、C組大鼠術(shù)前禁食8小時(shí)，禁水4小時(shí)。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，將右側(cè)頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動(dòng)脈。B、C組分別在術(shù)后第48h處死大

7、鼠切取移植靜脈，A組取右側(cè)頸外靜脈，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α。對(duì)比研究3組靜脈細(xì)胞因子的含量。
　　結(jié)果：
　　(1)兩組大鼠共30只全部成活，術(shù)后活動(dòng)、飲食均正常，切口愈合良好。取材時(shí)共30條橋靜脈均通暢，搏動(dòng)良好。兩組大鼠手術(shù)過(guò)程順利。B組手術(shù)時(shí)間、吻合時(shí)間均較A組長(zhǎng)，兩組相比P＜0.05，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組大鼠隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)膜和中膜

8、的厚度也逐漸增厚。B組大鼠在1W、2W和4W不同的時(shí)間點(diǎn)，內(nèi)膜和中膜的厚度分別與A組相比較，P＞0.05。差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有靜脈橋的內(nèi)膜和中膜的厚度均有逐漸增厚的趨勢(shì)。兩種劑量的熊果酸對(duì)內(nèi)膜和中膜的增厚均有不同程度的抑制作用。相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)不管是內(nèi)膜還是中膜的厚度，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本實(shí)驗(yàn)表明，每天給予的熊果酸劑量不同，對(duì)血管增生的

9、抑制效果也不同。30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增生的效果。
　　3組靜脈橋在不同的時(shí)間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見到PCNA陽(yáng)性細(xì)胞，兩種不同濃度的熊果酸均具有抑制細(xì)胞增殖的作用。相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖指數(shù)，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)的熊果酸較15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜細(xì)胞增

10、殖的效果。
　　3組靜脈橋在不同的時(shí)間所取的標(biāo)本內(nèi)膜和中膜均能見到凋亡細(xì)胞。相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)膜細(xì)胞凋亡指數(shù)，B組與A組相比P＜0.05，C組與A組相比P＜0.05，C組與B組相比P＜0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的效果。兩種不同濃度的熊果酸均具有誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞增殖的作用。相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)中膜細(xì)胞凋亡指數(shù)B組與A組相比P＞0.05，C組與A組相比P＞0.05，C組與

11、B組相比P＞0.05。本研究表明，30mg/(kg·d)和15mg/(kg·d)的熊果酸并沒(méi)有誘導(dǎo)中膜細(xì)胞凋亡的作用。
　　(3)B組和C組細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α均較A組顯著增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在術(shù)后應(yīng)用熊果酸組治療的C組較未予熊果酸的B組細(xì)胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　(1)兩種模型均為目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中為反映冠狀

12、動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植靜脈再狹窄病理過(guò)程所用的理想模型。Cuff套管法建立大鼠頸外靜脈移植到頸總動(dòng)脈模型，操作簡(jiǎn)單，成功率高，死亡率低，短期內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng)，有利于開展大規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。此模型是研究移植靜脈內(nèi)膜增生和狹窄的發(fā)病機(jī)制、病理變化及探討其防治措施理想的動(dòng)物模型。
　　(2)熊果酸能夠抑制靜脈移植后的再狹窄。劑量為30mg/(kg·d)的熊果酸比15mg/(kg·d)具有更好的抑制內(nèi)膜和中膜增殖的效果。劑量為30mg/(kg

13、·d)的熊果酸比15 mg/(kg·d)具有更好的誘導(dǎo)內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的效果。但30mg/(kg·d)和15mg/(kg·d)的熊果酸并沒(méi)有誘導(dǎo)中膜細(xì)胞凋亡的作用。
　　(3)在移植靜脈再狹窄的模型中，各種因素導(dǎo)致血管的炎癥，進(jìn)而引起血管壁重塑是靜脈再狹窄最重要的原因。熊果酸能夠抑制靜脈移植后血管壁的炎癥，有效防治靜脈的再狹窄。熊果酸的作用機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB的活化，抑制了MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α基因表達(dá)。術(shù)后