阿托伐他汀抑制NF-κB活化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下三個(gè)方面進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：1、阿托伐他汀(Atorvastatin，ATOR)對NF-κB活性及IκBα磷酸化和表達(dá)的影響；2、阿托伐他汀對泛素系統(tǒng)中IκBα降解相關(guān)酶的影響；3、阿托伐他汀對NF-κB上游信號傳導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)鍵激酶和受體的影響。 研究方法： 1、人血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304的培養(yǎng)及傳代。 2、第一部分。實(shí)驗(yàn)分組為：空白組、LPS組、阿托伐他汀低、中、高濃度組，實(shí)驗(yàn)時(shí)各組加入無血清培養(yǎng)基，低濃度組

2、加入阿托伐他汀鈣終濃度0.1mM、中濃度組加入阿托伐他汀鈣終濃度1.0mM、高濃度組加入阿托伐他汀鈣終濃度10mM，分別孵育24h，之后除空白組外各組均加入脂多糖(終質(zhì)量體積濃度10 mg·L<'-1>)、作用0.5h，收集細(xì)胞。采用免疫熒光法觀察p65在細(xì)胞內(nèi)分布的改變；RT-PCR檢測p65mRNA、IKBamRNA表達(dá)的變化；用Westem blot檢測p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)的變化。 3、第二部分。實(shí)驗(yàn)分組

3、采用兩種方法：第一種方法同前；第二種方法將細(xì)胞分為五組，實(shí)驗(yàn)時(shí)各組加入含終濃度0.1mM阿托伐他汀鈣的無血清培養(yǎng)基，分別孵育0h、1h、6h、12h、24h、之后各組均加入終質(zhì)量濃度10mg·L<'-1>的脂多糖，作用0.5h，收集細(xì)胞。RT-PCR法檢測泛素酶E3RSIκB mRNA及UBC5mRNA表達(dá)的變化；用Western blot檢測E3RSIκB及UBC5蛋白表達(dá)的變化。 4、第三部分。實(shí)驗(yàn)分組同2，流式細(xì)胞法檢測L

4、PS受體TLR4表達(dá)的變化；用Western blot檢測PKCO、p-IKKβ蛋白表達(dá)的變化。 研究結(jié)果： 1、阿托伐他汀能抑制LPS刺激引發(fā)的NF-κB亞單位p65核移位，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。 2、阿托伐他汀能以劑量依賴的方式抑制LPS刺激引發(fā)的IκBα含量急劇下降；除阿托伐他汀高劑量組外，其余各組的Ird3αmRNA含量的增加沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、阿托伐他汀可以抑制LPS刺激引發(fā)的p-IκBα含

5、量增高，同樣呈現(xiàn)出劑量依賴性。 4、阿托伐他汀能以時(shí)間依賴的方式抑制LPS刺激引發(fā)的E3RSIκB及UBC5mRNA和蛋白含量升高；不同劑量阿托伐他汀對LPS刺激引發(fā)的E3RSIκB及UBC5 mRNA和蛋白含量升高的抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5、阿托伐他汀能以劑量依賴的方式抑制LPS刺激引發(fā)的TLR4表達(dá)升高；LPS刺激及阿托伐他汀干預(yù)對PKCθ含量沒有影響；阿托伐他汀能抑制LPS刺激引發(fā)的p-IKKβ蛋白含量增加并且呈現(xiàn)劑

6、量依賴性。 研究結(jié)論： 1、在LPS刺激情況下，阿托伐他汀是通過減少IκBα降解來抑制NF-κB活性增強(qiáng)的。 2、阿托伐他汀是通過減少IκBα磷酸化和減少p-IκBα降解來抑制：IκBα降解的。 3、阿托伐他汀是通過減少泛素系統(tǒng)中關(guān)鍵酶E3RSIκB及LIBC5的表達(dá)來抑制p-IκBα降解的。這種作用與阿托伐他汀作用的時(shí)間和劑量有關(guān)。 4、在LPS刺激情況下，阿托伐他汀可以通過減少細(xì)胞膜上LPS受