黃連素通過GRP78膜轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制研究.pdf

1、黃連素，又稱小檗堿，是一種異喹啉類植物性生物堿，從毛茛科植物黃連、蕓香科植物黃檗的干燥根莖中均可以提取到黃連素，有顯著的抗菌、消炎、抗氧化等作用。傳統(tǒng)中醫(yī)主要用于治療腹瀉、痢疾等胃腸道感染性疾病。1959年首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，20世紀90年代以來，大量研究報道表明黃連素主要是通過抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，以及阻滯細胞周期的方式來發(fā)揮抗腫瘤活性，但具體的作用機制仍不十分明確。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是哺乳動物細胞

2、中主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶。在腫瘤細胞中，GRP78是一種重要的應(yīng)激誘導(dǎo)因子。當腫瘤細胞處在應(yīng)激狀態(tài)下，會對GRP78的表達與定位產(chǎn)生不同程度的影響。近年的研究報道顯示，腫瘤細胞內(nèi)GRP78的膜轉(zhuǎn)位在一定程度上可能會誘發(fā)某些藥物對腫瘤細胞的產(chǎn)生促進凋亡的作用。
　　本研究利用黃連素處理結(jié)腸癌細胞HCT-116和乳腺癌細胞MCF-7，檢測細胞內(nèi)GRP78的表達以及定位變化，結(jié)果顯示GRP78表達總量沒有發(fā)生變化，但是其在膜上和胞

3、漿的表達量分配發(fā)生了變化，有更多的GRP78從胞漿轉(zhuǎn)位到細胞膜上，而且GRP78這種轉(zhuǎn)位與黃連素誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)。為了探究黃連素對腫瘤細胞的作用及其機制，本研究主要開展以下研究內(nèi)容：
　　1、通過MTT實驗與細胞克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，黃連素對結(jié)腸癌細胞HCT-116和乳腺癌細胞MCF-7的增殖有明顯的抑制作用。該抑制作用呈現(xiàn)出一種劑量依賴的方式。通過流式細胞術(shù)檢測不同濃度黃連素處理的結(jié)腸癌細胞HCT-116和乳腺癌細胞MCF

4、-7的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)黃連素能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。Western blotting和實時定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)黃連素處理后，腫瘤細胞中凋亡相關(guān)因子Caspase12和CHOP在蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)。
　　2、采用免疫熒光染色法觀察黃連素處理腫瘤細胞后的GRP78分布，同時通過細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提法檢測GRP78表達情況，發(fā)現(xiàn)黃連素處理使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78在表達量不變的情況下，發(fā)生了明顯的細胞膜轉(zhuǎn)位。運用相應(yīng)

5、抗體封堵細胞膜上GRP78后，黃連素誘導(dǎo)的細胞凋亡明顯緩解，表明腫瘤細胞表面GRP78介導(dǎo)了黃連素誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡。
　　3、探討黃連素誘導(dǎo)腫瘤細胞GRP78膜轉(zhuǎn)位的發(fā)生機制。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素處理后的HCT-116細胞與MCF-7細胞中ROS水平明顯升高。采用ROS抑制劑進行干預(yù)后，通過western blotting分別檢測細胞膜與細胞漿中GRP78的表達情況。結(jié)果表明，抑制ROS水平后，黃連素誘導(dǎo)的腫瘤細胞內(nèi)GRP78膜轉(zhuǎn)