內質網(wǎng)慶激介導COPD肺泡上皮細胞凋亡及GRP78抗凋亡作用.pdf

1、研究背景：肺泡上皮細胞凋亡是COPD發(fā)病的重要機制之一。內質網(wǎng)應激(ERS)介導的細胞凋亡途徑是一條新的細胞凋亡途徑。有關ERS標志性分子GRP78的生物學功能的研究已經(jīng)引起生物學家們的廣泛重視,GRP78在ERS時表達增加,被認為可以減輕ERS,從而減少細胞凋亡。GRP78表達上調的信號傳導通路目前不完全清楚,有研究提示p38MAPK途徑可以上調GRP78的表達。吸煙是COPD最重要的發(fā)病因素。香煙煙霧中富含氧自由基和多種毒性成分,氧

2、化應激和毒性物質都是ERS的誘發(fā)因素,因此吸煙很可能觸發(fā)ERS。國內外研究均證實,在COPD中,香煙煙霧可以引起p38MAPK的活化。結合上述研究,我們推測在COPD發(fā)生過程中,吸煙可能通過誘導ERS導致肺泡上皮細胞凋亡從而參與COPD肺氣腫的形成,在此過程中GRP78表達上調,發(fā)揮抗凋亡作用,p38MAPK途徑在香煙煙霧誘導肺泡上皮細胞GRP78表達過程中起重要的調控作用。本研究擬以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預的A549

3、細胞為主要模型,探討香煙煙霧誘導ERS的發(fā)生、GRP78的抗凋亡作用以及p38MAPK途徑在GRP78表達過程中的調控作用。
　　 第一章 COPD大鼠肺組織內質網(wǎng)應激與細胞凋亡
　　 目的：觀察COPD大鼠肺組織內質網(wǎng)應激的發(fā)生及肺泡上皮細胞的調亡情況。
　　 方法：24只Wistar大鼠隨機均分為2組:正常對照組和COPD模型組。采用被動吸煙加氣管內注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。造模完成后,測定各組大鼠的

4、肺功能、觀察肺組織病理學變化、免疫組化檢測GRP78在肺組織中的表達和分布,RT-PCR檢測GRP78、CHOPmRNA水平,Western blot檢測GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白水平。TUNEL法檢測肺泡上皮細胞凋亡。
　　 結果： COPD模型組大鼠FEV0.3/FVC(％)、動態(tài)肺順應性(Cdyn)均較對照組明顯降低,而氣道阻力(RI)明顯增高;免疫組化結果顯示GRP78表達于肺泡上皮細胞

5、、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞等細胞的細胞漿中,以肺泡上皮細胞明顯。對照組GRP78呈弱陽性表達,陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒;模型組GRP78呈強陽性表達,陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒。與對照組相比,模型組肺組織GRP78表達顯著增高;RT-PCR結果顯示COPD模型組大鼠支氣管肺組織中GRP78 mRNA和CHOPmRNA表達量較對照組顯著增高;Western blot結果顯示COPD模型組大鼠肺組織中GRP78、CHOP、active caspa

6、se—12蛋白表達較正常對照組顯著增高;TUNEL法結果顯示COPD模型組肺泡上皮細胞凋亡指數(shù)較正常對照組顯著增高。
　　 結論：采用被動吸煙加氣管內注射脂多糖的方法,成功復制出了COPD大鼠模型;COPD大鼠肺組織發(fā)生了內質網(wǎng)應激,尤以肺泡上皮細胞明顯;COPD大鼠肺泡上皮細胞凋亡增加,內質網(wǎng)應激可能是介導肺泡上皮細胞發(fā)生凋亡的重要途徑。
　　 第二章香煙煙霧提取物誘導肺泡上皮細胞GRP78的表達及其抗凋亡作用

7、　　 目的：觀察CSE對A549細胞GRP78表達的影響,并探討GRP78抗細胞凋亡作用。
　　 方法：第一部分,體外培養(yǎng)A549細胞,給予不同濃度(0％-10％)和不同時間(0h-24h)的CSE干預后,以RT-PCR、Western blot分別檢測GRP78 mRNA和蛋白表達;第二部分,將A549細胞分為四個處理組:對照組,5％CSE組,GRP78siRNA+5％CSE組,controlsiRNA+5％CSE組。以RT

8、—PCR、Western blot分別檢測GRP78 mRNA和蛋白的表達水平,Western blot檢測active caspase-3蛋白表達水平,TUNEL檢測A549細胞凋亡指數(shù)(AI)的變化。
　　 結果：隨著CSE濃度的增加或干預時間的延長,A549細胞GRP78 mRNA及GRP78蛋白表達量逐漸增加,以5％CSE、干預12h組增加最明顯,但繼續(xù)增加CSE濃度或延長干預時間,GRP78表達并不增加,反而下降;小干

9、擾GRP78后,RT-PCR、Western blot檢測小干擾組GRP78表達顯著下降,GRP78siRNA成功下調了GRP78基因表達; GRP78水平下調后,A549細胞active caspase-3的蛋白表達水平和細胞凋亡指數(shù)與單純的CSE刺激組比較顯著升高。
　　 結論：低濃度、短時間CSE刺激后,A549細胞啟動了保護性的非折疊蛋白反應,GRP78表達上調。但高濃度、長時間CSE刺激,內質網(wǎng)出現(xiàn)功能障礙,其保護機制

10、失代償,GRP78表達反而下降;GRP78抵抗香煙煙霧提取物誘導的A549細胞凋亡。
　　 第三章 p38MAPK在香煙煙霧提取物誘導肺泡上皮細胞GRP78表達過程中的調控
　　 目的：明確p38MAPK在CSE誘導肺泡上皮細胞GRP78表達過程中的調控作用。
　　 方法：第一部分,24只Wistar大鼠隨機均分為2組:正常對照組和COPD模型組。采用被動吸煙加氣管內注射脂多糖法建立大鼠COPD模型。造模完成后,

11、Western blot檢測各組大鼠肺組織內P-p38、GRP78蛋白表達水平,并將二者進行相關性分析;第二部分,將A549細胞分為三個處理組:對照組,5％CSE組,SB203580+5％CSE組,以RT-PCR、Western blot分別檢測GRP78 mRNA和蛋白的表達水平變化。
　　 結果： COPD模型組大鼠支氣管肺組織中P-p38蛋白表達水平較對照組顯著升高,且P-p38蛋白水平與GRP78蛋白表達呈正相關(r=0