介孔、納米二氧化硅誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其機制的研究.pdf

1、二氧化硅種類繁多、應(yīng)用廣泛，納米二氧化硅因其獨特的性質(zhì)在生物傳感器、藥物載體、生物活性物質(zhì)載體等生物醫(yī)藥領(lǐng)域吸引了大量研究者的目光。納米二氧化硅是典型的肺毒物，其生物安全性阻礙了它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。介孔二氧化硅是近年來新研制的一種新型二氧化硅材料，相比普通納米二氧化硅來說擁有對機體的毒性效應(yīng)更低、表面更易修飾、孔徑更大、更易載藥等特點，這使得介孔二氧化硅在生物載藥研究領(lǐng)域頗受關(guān)注。但目前對于介孔二氧化硅的毒性研究結(jié)果并不一致，因此，

2、本課題主要目的是以納米二氧化硅、介孔二氧化硅為研究對象，探討兩種材料對人肺泡上皮細(xì)胞(HPAEPIC)的毒性作用，如何誘導(dǎo)HPAEPIC凋亡、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路及其分子機制。
　　方法:
　　1、介孔、納米二氧化硅表征使用透射電子顯微鏡對介孔、納米二氧化硅形態(tài)和粒徑大小進行測定;使用馬爾文粒度分析儀檢測納米、介孔二氧化硅顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)液中的粒徑和ζ電位;使用全自動比表面積及孔隙度分析儀分析納米材料比表面積與孔徑。
　　

3、2、介孔、納米二氧化硅對HPAEPIC毒性研究通過CCK-8實驗檢測不同濃度介孔、納米二氧化硅對HPAEPIC活性的影響;使用倒置顯微鏡觀察染毒后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;使用流式細(xì)胞術(shù)檢測染毒后HPAEPIC凋亡率變化;通過透射電鏡觀察介孔、納米二氧化硅對HPAEPIC超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　3、介孔、納米二氧化硅引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制研究通過PCR實驗檢測加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路特異性抑制劑4-PBA前后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因BIP、CHOP的

4、表達情況，Western Blot實驗考察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白BIP的表達，考察介孔、納米二氧化硅誘導(dǎo)HPAEPIC凋亡的作用機制。
　　結(jié)果:
　　1、介孔、納米二氧化硅表征TEM觀察下納米二氧化硅顆粒外形呈不規(guī)則球形，材料表面粗糙，粒徑分布多集中于16nm;介孔二氧化硅電鏡下呈規(guī)則球形，由硅內(nèi)核和包圍著內(nèi)核的殼結(jié)構(gòu)兩部分組成，殼結(jié)構(gòu)分布著規(guī)則的、孔徑為3nm的孔道，分散均勻，無團聚現(xiàn)象。介孔二氧化硅的DMEM分散粒徑為

5、854.3nm，ζ電位為-22.6mV，兩種材料分散在培養(yǎng)液DMEM中的粒徑相差無幾，在DMEM中檢測到的ζ電位結(jié)果幾乎一樣。
　　2、介孔、納米二氧化硅對HPAEPIC毒性作用納米二氧化硅、介孔二氧化硅引起細(xì)胞活力改變。隨著染毒劑量的升高，納米二氧化硅與介孔二氧化硅對細(xì)胞抑制作用逐漸增強，納米二氧化硅染毒HPAEPIC24h后IC50為125.81μg/ml，介孔二氧化硅染毒HPAEPIC24h后IC50為5212.47μg/m

6、l，提示HPAEPIC對納米二氧化硅的作用更加敏感。納米二氧化硅、介孔二氧化硅引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的具體表現(xiàn)為:細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞變圓變皺縮、細(xì)胞空泡增加。納米二氧化硅、介孔二氧化均引起HPAEPIC超微結(jié)構(gòu)改變。納米二氧化硅與介孔二氧化硅皆可積聚在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，納米二氧化硅可引起細(xì)胞微結(jié)構(gòu)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，介孔二氧化硅對細(xì)胞微結(jié)構(gòu)作用影響不如納米二氧化硅嚴(yán)重。納米二氧化硅、介孔二氧化硅誘導(dǎo)HPAEPIC凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

7、激通路可能參與了納米二氧化硅、介孔二氧化硅誘導(dǎo)HPAEPIC凋亡反應(yīng)。
　　3、介孔、納米二氧化硅引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制通過RT-qPCR檢測加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑4-PBA前后，納米二氧化硅、介孔二氧化硅染毒HPAEPIC24h后細(xì)胞BIP、CHOP mRNA表達情況，通過Western Blot檢測BIP蛋白的表達情況，BIP mRNA、CHOP mRNA被激活，BIP蛋白表達，加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA后，BIP

8、mRNA、CHOP mRNA表達水平下降，提示納米二氧化硅、介孔二氧化硅染毒HPAEPIC激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，介孔二氧化硅與納米二氧化硅相比，對人肺泡上皮細(xì)胞的毒性作用更小，引起凋亡的程度更低，但同樣可以被細(xì)胞攝取，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變，凋亡率增加，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活。介孔二氧化硅誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中BIP、CHOP基因與蛋白的上調(diào)有關(guān)。本研究為充分認(rèn)識和評價納米