液態(tài)納米組織工程骨對兔實驗性股骨頭缺血性壞死修復作用的實驗研究.pdf

1、目的：股骨頭壞死在骨科領域屬于多見病、常見病，對髖關節(jié)具有非常大的破壞性和退行性改變，致殘率高和病程長是其特點，對人民的健康危害嚴重。股骨頭壞死治療不當，約80％的患者在1～4年內可出現(xiàn)股骨頭塌陷。一旦股骨頭出現(xiàn)塌陷，患者的髖關節(jié)功能就意味著毀損。因此治療的主要目的是防止股骨頭塌陷，保存自體股骨頭。由于股骨頭壞死的發(fā)病機制還未完全明確，因此對股骨頭壞死的治療尚無有效的方法。目前有很多保髖手術方法，如帶血管蒂的腓骨移植、髓芯減壓、表面置換

2、、血管束植入等，均取得一定的治療效果，但沒有一種技術是非常滿意的。近年來有研究表明納米羥基磷灰石/膠原(nano2hydroxyapatite/collagen，nHAC)的成分和微結構與天然骨非常相似，礦物相是含有碳酸根的羥基磷灰石，晶粒尺寸在納米量級，結晶度低，礦物和Ⅰ型膠原蛋白基質均勻混合。自體骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植可誘導分化成骨細胞早已在體內外實驗中得到證實。在動物模型上采用干細胞移植治療股骨頭壞死，亦取得良好效果。

3、本實驗試圖用液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)修復股骨頭骨缺損，以研究其對股骨頭壞死區(qū)修復的效果，探索用液態(tài)納米組織工程骨治療股骨頭壞死的新領域。
　　方法：1.實驗前的準備工作及實驗動物的分組：在做實驗前一周飼養(yǎng)好實驗動物，如果有疾病則淘汰，如果健康則做為實驗動物，手術前一天給予實驗動物禁食水。選好之24只成年新西蘭大白兔，隨機分為A、B兩組，每組12只，A組為液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)移植組，B組為BM

4、SCs聯(lián)合自體松質骨移植組。術后2，4，6，8周A、B兩組分別處死3只新西蘭大白兔。2.BMSCs的取得、培育及混合載體：做實驗前1周從新西蘭大白兔髂后上嵴處抽取骨髓，把骨髓液種植于選好之6孔細胞培養(yǎng)板內，板內培養(yǎng)液為20％胎牛血清DMEM液，培養(yǎng)板置入細胞培養(yǎng)箱內，以密度為1×106/cm2傳代，傳至第3代。第3代細胞培養(yǎng)至傳代密度時制成細胞懸液，A組種植在準備好的納米材料(nHAC)上，制備成組織工程骨，在細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時，

5、待手術時植入被實驗動物股骨頭壞死區(qū)。B組與明膠海綿顆?；旌?，在細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時，手術時將BMSCs和明膠海綿混合物及自體松質骨顆粒一并植入實驗動物股骨頭壞死區(qū)。3.制備動物模型及實驗方法：所有實驗動物的兩側股骨頭都做實驗。實驗動物采取俯臥位，麻醉藥選硫噴妥鈉注射液，麻醉時按40mg/kg的硫噴妥鈉注入腹腔內。麻醉成功后消毒、鋪無菌巾單。取雙側髖關節(jié)后側入路，暴露雙側股骨頭，把液氮棉團溥于股骨頭處連續(xù)冷凍3分鐘，股骨頭壞死模型即制

6、成。自然復溫后用直徑3.5mm鉆頭從股骨頸內后側向股骨頭內鉆孔，鉆入深度為4mm，不穿過關節(jié)軟骨。A組鉆孔后在壞死模型壞死區(qū)植入液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)，逐層縫合切口。B組鉆孔后在壞死模型壞死區(qū)植入BMSCs+明膠海綿顆粒+自體松質骨顆粒，逐層縫合切口。4.HE染色：從10％福爾馬林液中取出浸泡的股骨頭標本，于股骨頸基底處鋸開，把標本做好標記，用8％甲酸溶液把標本脫鈣，共換液三次，脫鈣時間為兩周。脫水、透明、浸蠟、修塊

7、，做成5μm切片，水浴，鋪片，烤片。最后做HE染色：熔蠟，酒精梯度水化，亞甲蘭染色，酸化，返蘭，伊紅染色，再用酒精梯度脫水，透明。再用光學樹脂封片。5.X線及組織學觀察：通過X射線片觀看股骨頭標本鉆孔區(qū)骨密度和骨小梁的改變狀況。蘇木精-伊紅染色切片，光鏡觀看股骨頭標本鉆孔區(qū)細胞及骨小梁的改變狀況。6.統(tǒng)計學方法：采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件，分析股骨頭標本缺損區(qū)新生成的骨小梁圖像，對其面積百分比均值進行t檢驗分析。
　　結果：1

8、.標本股骨頭X線檢查：A組2周時標本X線顯示，鉆孔區(qū)以外的骨小梁結構完整，鉆孔區(qū)內在植入液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)的部位高密度影較明顯。4周標本X線顯示，鉆孔區(qū)以外的骨質密度增加，但鉆孔區(qū)以外的骨小梁結構完整，鉆孔區(qū)內植入物密度有輕度減低。6周時標本X線顯示，鉆孔缺損區(qū)以外骨質密度增加，鉆孔區(qū)以外的骨小梁結構紊亂，在鉆孔區(qū)內所植液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)部分的密度略高，有骨小梁出現(xiàn)，鉆孔區(qū)內所植物與鉆孔區(qū)

9、外界限模糊。第8周時標本X線顯示，在股骨頭鉆孔缺損區(qū)以外的骨密度增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，并且有骨下囊樣變。在實驗股骨頭鉆孔區(qū)內植入物有部分骨密度接近正常，有骨小梁出現(xiàn)，鉆孔區(qū)內植入物與鉆孔區(qū)外界限模糊程度比6周時的標本加重。B組：2周時實驗股骨頭標本X線顯示鉆孔區(qū)以外骨質密度增加，骨小梁結構完整鉆孔區(qū)內所植物的密度減低。4周時的標本顯示實驗股骨頭標本鉆孔區(qū)外骨質密度增加，骨小梁結構完整，在鉆孔區(qū)內植入物密度增高，但與正常骨密度相比，還

10、顯略低。6周時的實驗股骨頭標本顯示在鉆孔區(qū)以外骨質密度有所增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，同時有軟骨下囊樣變性。在鉆孔區(qū)內發(fā)現(xiàn)有稀疏骨小梁。8周時的標本顯示，實驗股骨頭標本在鉆孔區(qū)以外的骨質密度增加，骨小梁出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，并且出現(xiàn)軟骨下囊樣變性。在鉆孔區(qū)內可發(fā)現(xiàn)有骨小梁，植入物密度接近正常，植入物與鉆孔區(qū)界限表現(xiàn)模糊?？傮w而言A組實驗股骨頭缺損區(qū)內植入的液態(tài)納米組織工程骨(nHAC/BMSCs)的密度由高逐漸降低最后接近正常骨小梁。B組實驗股骨

11、頭的缺損區(qū)內植入的BMSCs+明膠海綿顆粒+自體松質骨顆粒，密度開始降低然后再升高，最后接近正常骨小梁結構。2.實驗股骨頭標本的組織學檢查：A組實驗動物的股骨頭標本術后2周時，在實驗股骨頭標本的鉆孔缺損區(qū)內發(fā)現(xiàn)缺損區(qū)邊緣有較多的新生骨小梁及類骨質，缺損區(qū)內有大量的成骨細胞。4周時股骨頭的缺損區(qū)內發(fā)現(xiàn)有類骨質填充及大量骨小梁形成。6周時實驗股骨頭缺損區(qū)內發(fā)現(xiàn)骨髓組織及較成熟的骨小梁。在第8周時發(fā)現(xiàn)股骨頭缺損區(qū)內有大量骨髓組織及成熟的骨小梁

12、。B組術后2周時，在鉆孔區(qū)中心被炎癥細胞充填，在鉆孔區(qū)的邊緣有較多的新生骨組織，在新生骨的內側有一個成骨細胞層。4周時在實驗股骨頭標本的鉆空區(qū)內有較多的新生骨小梁，但并未充滿整個股骨頭，有的有少量骨組織在標本鉆孔區(qū)的中央，有的在鉆孔區(qū)內未發(fā)現(xiàn)骨組織。6周時比4周時的情況是有血管出現(xiàn)，有骨髓組織，骨小梁較成熟。8周時實驗股骨頭鉆孔區(qū)邊緣被骨髓組織、骨小梁組織充滿。
　　統(tǒng)計學分析：術后8周時，A、B兩組實驗動物股骨頭缺損區(qū)內的骨小梁