原發(fā)性痛風(fēng)不同中醫(yī)證型患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體的研究.pdf

1、研究背景及目的：痛風(fēng)是因嘌呤代謝障礙和/或尿酸排泄減少、血尿酸持續(xù)升高而導(dǎo)致尿酸鈉(MSU)結(jié)晶析出并沉積于組織或器官引起的一組臨床癥候群。有研究顯示炎癥與免疫在痛風(fēng)的發(fā)病中具有一定的作用。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)是固有免疫的重要成員，其可以識(shí)別MSU形成活化的NLRP3炎性體，進(jìn)而引起IL-1β等的成熟和釋放而引起炎癥反應(yīng)。已知Pre-mRNA的選擇性剪接是控制基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制，選擇性剪接的不同

2、變化與細(xì)胞生理、發(fā)育調(diào)控以及疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在特定的環(huán)境下發(fā)生特定的選擇性剪接可能是某些疾病的分子信號(hào)，也可能是導(dǎo)致某些疾病的原因。然而，NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體在原發(fā)性痛風(fēng)不同中醫(yī)證型患者發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚，故本研究擬以此為切入點(diǎn)，研究NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體在原發(fā)性痛風(fēng)不同中醫(yī)證型患者發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法(1)：用半定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和/或?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法

3、檢測96例原發(fā)性痛風(fēng)(PG)患者[急性期組44例(APPG)、非急性期組52例(NAPPG)]和30名健康對(duì)照(HC)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)水平。用Western blot檢測PG患者和HC PBMCs中NLRP3、PYCARD、CASP1、NF-κB(p50)蛋白表達(dá)水平，用ELISA檢測PG患者和HC血漿中IL-1β、IL-2、TNF-α的蛋白表達(dá)水平，采用免疫比濁法測定血漿CRP

4、水平。多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)，表達(dá)量組間分析采用t檢驗(yàn)或秩變換分析進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　方法(2)：收集12例APPG與13例NAPPG患者及8名HC外周靜脈血，分別以MSU(50μg/mL)、內(nèi)毒素脂多糖(LPS)(0.2μg/mL)、MSU(50μg/mL)+LPS(0.2μg/mL)進(jìn)行刺激培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6h、12h、24h后分離血漿并提取PBMCs，

5、用RT-PCR和/或qRT-PCR法檢測各組刺激前后 NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)水平，用Western blot檢測各組刺激前后PBMCs中NLRP3、PYCARD、CASP1、NF-κB(p50)蛋白表達(dá)水平，用ELISA檢測各組刺激前后血漿IL-1β蛋白表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)方法同前。
　　方法(3)：檢測44例APPG、52例NAPPG和30名HC白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(GR)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(LY

6、)、單核細(xì)胞絕對(duì)值(MO)、丙氨酸氨基移換酶(ALT)、門冬氨酸氨基移換酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、尿素(Ur)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、載脂蛋白 B100(apoB100)、載脂蛋白A1(apoA1)，比較上述指標(biāo)的差異并分析其與NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體mRN

7、A表達(dá)的相關(guān)性，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組間兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)，表達(dá)量組間分析采用t檢驗(yàn)或秩變換分析進(jìn)行檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。
　　方法(4)：收集3例APPG與3例NAPPG患者及4名HC外周靜脈血，分別以小檗堿(BBR)5μg/mL與10μg/mL進(jìn)行刺激培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6h、12h后分離血漿并提取PBMCs，用qRT-PCR法檢測各組刺激

8、前后NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)水平，用ELISA檢測各組刺激前后血漿CASP1蛋白表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)方法同前。
　　結(jié)果(1)：PG急性與非急性期組以及濕熱瘀阻證(ODHS)、痰瘀互結(jié)證(IPSBS)、脾虛濕困證(PDIDS)、氣血虧虛證(QBDS)各組 NLRP3炎性體基因及其部分轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)與HC組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；PG不同期與不同中醫(yī)證型各組患者NLRP3、PYCARD

9、、CASP1、NF-κB(p50)蛋白表達(dá)與HC組比較也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；PG不同期與不同中醫(yī)證型各組患者血漿 IL-1β、IL-2、TNF-α、CRP蛋白表達(dá)與HC組比較也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；且各組間相比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)。
　　結(jié)果(2)：經(jīng)MSU、LPS、MSU+LPS刺激后，PG不同期與不同中醫(yī)證型各組NLRP3炎性體基因及其部分轉(zhuǎn)錄剪

10、接體mRNA表達(dá)與HC及刺激前對(duì)照組(CG)比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；刺激后PG不同期與不同中醫(yī)證型各組患者NLRP3炎性體及NF-κB(p50)蛋白表達(dá)與HC及CG組比較也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；刺激后PG不同期與不同中醫(yī)證型各組患者血漿IL-1β蛋白表達(dá)與HC及CG組比較也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；且各組間相比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)。<

11、br>　　結(jié)果(3)：臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示：APPG與NAPPG組部分血常規(guī)、肝腎功能、血脂指標(biāo)與HC組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,P＜0.01)；相關(guān)性分析顯示APPG組NLRP3炎性體部分基因及其轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)與其部分臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)具有相關(guān)性(P＜0.05)，且APPG組NLRP3炎性體部分基因及其轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)與PBMCs的IL-1β mRNA及血漿IL-1β蛋白表達(dá)均具有相關(guān)性(P＜0.05)，而NAP

12、PG與HC組NLRP3炎性體基因及其轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)與其臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及IL-1βmRNA、IL-1β蛋白表達(dá)均未見相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)果(4)：經(jīng)BBR5μg/mL與10μg/mL刺激后，PG不同期組NLRP3、PYCARD、CASP1、NLRP3-4、PYCARD-1 mRNA表達(dá)與刺激前對(duì)照組(CG)比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)；刺激后PG不同期組痛風(fēng)患者血漿CASP1蛋白表達(dá)與CG組比

13、較也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結(jié)論：在PG不同期與不同中醫(yī)證型患者的炎癥反應(yīng)中，NLRP3炎性體基因轉(zhuǎn)錄剪接體可能發(fā)揮重要的作用；MSU對(duì)NLRP3炎性體部分基因及其轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)具有一定的調(diào)控作用，其可能為MSU誘導(dǎo)PG發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)；PG不同中醫(yī)證型的變化可能與MSU調(diào)控NLRP3炎性體部分基因及其轉(zhuǎn)錄剪接體mRNA表達(dá)相關(guān)；小檗堿對(duì)痛風(fēng)患者表達(dá)異常的NLRP3炎性體及其部分基因轉(zhuǎn)錄剪接