pND6-1質(zhì)粒中重復(fù)萘降解基因的鑒定和生態(tài)意義.pdf

1、許多細(xì)菌具有降解環(huán)境中生物異源物質(zhì)的能力，其降解基因常位于質(zhì)粒上。萘是常見(jiàn)的環(huán)境污染物，在工業(yè)廢水中的檢出率高達(dá)10％。ND6是本實(shí)驗(yàn)室分離的高效降解萘的菌株，它可以在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中于48h內(nèi)將2g/L的萘降解98％。該菌株含有兩個(gè)大質(zhì)粒，其中與萘降解有關(guān)的是101858bp的質(zhì)粒pND6-1，另一個(gè)122055bp的質(zhì)粒pND6-2功能不明。pND6-1中9個(gè)萘降解基因(nahAaAbAcAdBFCED)構(gòu)成上游操縱子，它們編碼的

2、酶催化萘降解成水楊酸，另外11個(gè)萘降解基因(nahGTHINLOMKJY)構(gòu)成下游操縱子，負(fù)責(zé)將水楊酸降解成兒茶酚，并通過(guò)間位裂解途徑將兒茶酚進(jìn)一步降解成可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)的小分子物質(zhì)。 尼龍寡聚體質(zhì)粒pOAD2、2,4-D質(zhì)粒pJP4及萘降解菌PseudomonasstutziriAN10的染色體上都存在重復(fù)降解基因。重復(fù)降解基因的存在并非偶然事件，它是細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。生物信息學(xué)分析表明，萘降解質(zhì)粒pND6-1

3、中除了“經(jīng)典”的水楊醛脫氫酶基因nahF和水楊酸羥化酶基因nahG外，還存在它們的重復(fù)基因nahV和nahU，這兩個(gè)重復(fù)基因分別位于萘降解的上游操縱子和下游操縱子之外。 本論文的主要研究?jī)?nèi)容是：通過(guò)16SrRNA基因序列分析和Biolog代謝指數(shù)測(cè)定確定ND6菌株的分類地位；通過(guò)濾膜雜交實(shí)驗(yàn)確定pND6-1質(zhì)粒能否進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移；克隆和表達(dá)兩個(gè)重復(fù)的萘降解基因nahV和nahU并對(duì)它們編碼的酶進(jìn)行純化和鑒定；通過(guò)DNA雜交實(shí)驗(yàn)證明

4、nahU基因存在的普遍性并對(duì)其生態(tài)意義進(jìn)行探討。 對(duì)ND6菌株的16SrRNA基因序列所進(jìn)行的PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序和Blast分析表明，它與假單胞菌屬的多株細(xì)菌具有99％的同源性。Biolog代謝指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示ND6菌株與惡臭假單胞菌的匹配程度為0.65。綜合上述兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ND6菌株被鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonaseputida)。 濾膜雜交實(shí)驗(yàn)表明，ND6菌株的pND6-1質(zhì)粒可以通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移到

5、大腸桿菌AD256菌株中。由于ND6菌株不含有接合轉(zhuǎn)移基因，所以推測(cè)pND6-2質(zhì)粒中的8個(gè)接合基因與pND6-1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移有關(guān)。這是第一個(gè)報(bào)道，一個(gè)質(zhì)粒的接合基因可以促進(jìn)另外一個(gè)降解質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。 以pND6-1為模板，設(shè)計(jì)引物分別對(duì)重復(fù)的水楊醛脫氫酶基因nahV和重復(fù)的水楊酸羥化酶基因nahU進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后分別在高表達(dá)載體pET-21b(+)中定向克隆，并在E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中于20℃低溫表達(dá)。將C-端帶

6、有HisTag的重組蛋白通過(guò)Ni-NTA親和層析加以純化，然后對(duì)兩種新酶NahV和NahU的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)研究，并與它們對(duì)應(yīng)的同工酶NahF和NahG的性質(zhì)進(jìn)行比較。 NahV具有廣泛的底物范圍，它能以水楊醛、5-氯水楊醛、間硝基苯甲醛、辛醛、甲醛、鄰硝基苯甲醛、鄰甲氧基苯甲醛、戊二醛和乙二醛為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，而且NahV和NahF對(duì)不同底物的催化效率不同。NahV對(duì)底物水楊醛和輔酶NAD+的米氏常數(shù)Km值及最大反應(yīng)速度Vm

7、ax都小于NahF，這表明NahV對(duì)底物濃度更加敏感，相對(duì)更低的底物濃度就可以促進(jìn)酶促反應(yīng)的發(fā)生，但是在相同底物濃度的情況下NahF催化的反應(yīng)速度要比NahV快。Fe2+對(duì)NahV和NahF都有顯著的激活作用，而Cu2+、Zn2+只對(duì)NahV有激活作用。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水楊醛脫氫酶重復(fù)基因nahV與其它菌株的水楊醛脫氫酶的氨基酸序列同源性僅為56％，是完全不同的新基因。所有醛脫氫酶都具有保守的氨基酸序列LELGGKSP，但是在Nah

8、V的保守氨基酸序列中，絲氨酸(S)被丙氨酸(A)所替換。GPC凝膠色譜分析結(jié)果表明，NahV蛋白可能由兩個(gè)相同的亞基構(gòu)成。 NahU也具有廣泛的底物范圍，能以水楊酸、乙酰水楊酸、磺基水楊酸、甲基水楊酸、氯代水楊酸和3,5-二硝基水楊酸為底物進(jìn)行催化反應(yīng)。NahU對(duì)底物水楊酸和輔酶NADH的Km值和Vmax值都要大于NahG。核酸序列比較表明，水楊酸羥化酶重復(fù)基因nahU是與nahG和另一個(gè)重復(fù)基因nahW都不相同的新基因。Nah

9、U和NahG都屬于單加氧酶家族，它們都擁有輔酶FAD的結(jié)合位點(diǎn)GxGxxG。 以質(zhì)粒pND6-1上“經(jīng)典”的水楊酸羥化酶基因nahG和重復(fù)的水楊酸羥化酶基因nahU為探針，分別與分離自紀(jì)莊子污水處理廠的活性污泥和大港油田及天津香料廠混合廢水的萘降解菌的總DNA雜交，結(jié)果表明，在被檢測(cè)的14個(gè)菌株中都存在nahG基因，而nahU基因只存在于來(lái)自混合工業(yè)廢水的菌株中。這表明，類nahU基因廣泛存在于自然界的萘降解細(xì)菌中，但不是必需的