HCMV UL82基因重組質(zhì)粒在HFF中的表達與純化鑒定.pdf

1、人巨細胞病毒含有約20～25種蛋白質(zhì)，其中在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制中有3種蛋白作用最為重要，即由ORFUL82編碼的磷蛋白pp71、ORFUL83編碼的pp65和ORFUL69編碼的PUL69。上述3種蛋白共同的特點是啟動HCMV對宿主細胞的感染和病毒的復(fù)制，同時在逃逸T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明，在這3種間層蛋白中以O(shè)RFUL82編碼的蛋白pp71的作用最為顯著，該pp71蛋白單獨存在時，是一種較強

2、的抗原蛋白，可刺激機體產(chǎn)生抗體，有助于清除病毒；在器官移植者,HCMV感染后pp71蛋白的產(chǎn)生可以明顯增強細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達，從而引起移植物血管病變和排斥反應(yīng)[1]。在視網(wǎng)膜母細胞瘤,pp71蛋白的產(chǎn)生可以引起腫瘤蛋白P105、P107、P130等的衰變[2,3]。pp71蛋白可以誘導(dǎo)靜止的細胞進入細胞周期并使它們停止在G1晚期，而這段時期對病毒復(fù)制最為有利，所以它能夠增加病毒繁殖，加快病毒在細胞間傳遞，體外將HCM

3、V轉(zhuǎn)染人纖維細胞后，病毒DNA復(fù)制效率在共轉(zhuǎn)染ORFUL82條件下，感染及復(fù)制效率增加了80倍[4-8]。研究證實pp71不僅對HCMV的IE1和IE2基因表達有促進作用，而且對晚期基因的表達以及病毒向正常宿主細胞的傳播具有促進和加強作用。因此,Baldick指出，ORFUL82(pp71蛋白)可作為抗HCMV病毒藥物設(shè)計的有效靶點[9]。 為進一步研究pp71蛋白基因在真核細胞-人包皮成纖維細胞(HFF)中的表達，為抗HCMV

4、pp71間層蛋白人源化基因工程抗體庫的建立、篩選奠定基礎(chǔ)，本研究進行了以下工作： 1.人包皮成纖維細胞的培養(yǎng) 取已凍存的第3代HFF細胞，在含10％小牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長接近鋪滿培養(yǎng)瓶壁時，按1：3分瓶培養(yǎng)，并標記傳代時間，代數(shù)及細胞名稱，于37℃、5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將傳至對數(shù)生長期的第14代HFF細胞封管凍存，以備后用。 2.基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71的鑒定

5、 (1)利用氯化鈣法將重組質(zhì)粒pSG5-pp71轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌內(nèi)。 (2)提取重組質(zhì)粒pSG5-pp71，以BamHI、EcoRI單酶和雙酶切方法初步鑒定陽性克隆基因；設(shè)計引物，用PCR方法擴增目的基因片段進一步鑒定重組質(zhì)粒，然后測序。對pp71基因DNA片段的測序結(jié)果，與基因庫中的標準序列比較，同源性約為99.82％,說明重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建。 3.基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71在HFF細胞中的表達與純化鑒定

6、 (1)基因重組質(zhì)粒pSG5-pp71在人包皮纖維細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。 (2)以抽提的HFF細胞總RNA為模板，合成的兩對引物為擴增對象，行RT-PCR檢測重組質(zhì)粒表達是否成功。 (3)表達產(chǎn)物的Westernblot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSG5-pp71的人包皮成纖維細胞裂解物依次經(jīng)Ni-NTA親和層析純化及SDS-PAGE蛋白電泳后,Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)在Mr為71000左右處有一條針對pp71抗體的特異性條帶，與理