HCH（六六六）降解菌的分離、鑒定和相關(guān)降解基因的克隆.pdf

1、本研究從長期受六六六污染的土壤中分離到3株能以γ-HCH為唯一碳源生長的六六六降解菌，分別命名為BHC-B、BHC-C和BHC-D。測定了此三株六六六降解菌的16S rRNA基因序列，提交至GenBank，其登陸號分別為No.KC191573，No.KC191574和No.KC191575。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株BHC-B，BHC-C和BHC-D聚成一枝，表現(xiàn)出很高的相似性;與該菌株16S rRNA基因序列相似性較高的菌株都是研究得較多

2、的六六六降解菌株，分別是Sphingobium japonicum UT26T，Sphingobiumfrancense Sp+T和Sphingobium indicum B90AT，相似性都大于99％(99.10％到99.72％)。綜合它們的形態(tài)和生理生化特征，以及系統(tǒng)進化分析，將菌株BHC-B、BHC-C和BHC-D皆鑒定為鞘脂菌屬(Sphingobium sp.)。
　　由于這些菌株相互之間的16S rRNA基因序列相似性大

3、于99％，因此從這個層面上區(qū)分它們比較困難。ERIC-PCR是一種常用于分析腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的方法，我們嘗試用它來鑒別這三株系統(tǒng)進化關(guān)系很近的六六六降解菌。結(jié)果顯示，這些菌株的ERIC-PCR產(chǎn)物在電泳圖片上呈現(xiàn)明顯不同的特征帶型，以這些帶型分析為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析和以16S rRNA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育分析具有很大的相關(guān)性。因此，ERIC-PCR在區(qū)分Sphingobium屬相近菌株方面有一定的前景。
　　為了進一步區(qū)分這

4、些菌株，我們又做了生理生化特性研究。BHC-B、BHC-C和BHC-D在LB平板上于30℃生長3天后，可形成表面光滑和濕潤的菌落;BHC-B菌落呈黃色，BHC-C菌落呈淺黃色，BHC-D呈亮黃色。它們的在LB培養(yǎng)基中最適生長溫度和pH分別為30℃和7.0;最適生長NaCl濃度為5g/L，當(dāng)NaCl濃度達到15％或者更高時，其生長受到抑制;當(dāng)250 mL的三角瓶裝液量小于100 mL時，其生長旺盛。在供試碳源中，對葡萄糖的利用最好;在供試

5、氮源中，對蛋白胨和牛肉膏利用最好;它們對鏈霉素和氨芐青霉素有抗性，可以耐受100 mg/L的鏈霉素和氨芐青霉素，對卡那霉素、氯霉素、新霉素和四環(huán)素等敏感。
　　BHC-B、BHC-C和BHC-D對γ-HCH降解的最適pH為7.0，最適溫度為30℃。對于無機鹽培養(yǎng)基中γ-HCH的降解而言，一定的范圍內(nèi)，BHC-B、BHC-C和BHC-D的接種量和降解率成正相關(guān);而通氣量對γ-HCH降解影響不大。菌株BHC-B，BHC-C和BHC-D

6、可以降解六六六的四種主要異構(gòu)體（α,β，γ和δ異構(gòu)體），其中菌株BHC-C表現(xiàn)出最高的降解率，在12h內(nèi)，它對α異構(gòu)體的降解率為60.1％，對β異構(gòu)體的降解率為30.2％，對γ異構(gòu)體的降解率為100％，對δ異構(gòu)體的降解率為38.6％。而菌株BHC-D表現(xiàn)出最低的降解率，在12h內(nèi)，它對α,β，γ和δ異構(gòu)體的降解率分別為34.3％，6.6％，98％和20.3％。它們對不同六六六異構(gòu)體的降解率都呈現(xiàn)如下規(guī)律:γ-HCH＞α-HCH＞δ-HC

7、H＞β-HCH。而對于同一種異構(gòu)體的降解來說，降解率呈現(xiàn)如下規(guī)律:BHC-C＞BHC-B＞BHC-D。
　　根據(jù)已報道的與六六六降解相關(guān)的lin系列基因序列設(shè)計引物，從BHC-B，BHC-和BHC-D菌株中都擴增到了符合預(yù)期大小的六個lin系列基因(linABCDE R)，其編碼蛋白的氨基酸序列和已經(jīng)報到的lin系列基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列相比，LinA，LinC，LinD，LinE和LinR表現(xiàn)出99％到100％的相似性。但是

8、LinB表現(xiàn)出2％到3％差異。詳細(xì)分析顯示，三株六六六降解菌的LinB中和已報道LinB中都含有高度保守氨基酸位點，它們是D108，E132和H272。但是在其它一些位點出現(xiàn)了不同的氨基酸殘基，在菌株BHC-B中，它們是N88，V123，H190和T274;在菌株BHC-D中，它們是S137，F(xiàn)173，A177和V248。這些差異也許是導(dǎo)致不同菌株對同種六六六異構(gòu)體降解率不同的原因，但是還需要進一步研究來驗證這個假設(shè)。
　　BHC