萘降解菌株Peseudomonas putida ND6中水楊醛脫氫酶NahV的生物學功能和轉錄調控.pdf

1、萘降解菌株Pseudomonas putida ND6分離自天津市南排污河,是一株高效降解萘的菌株,能在48 h內降解培養(yǎng)基中98％的萘(2 g/L)。同大部分萘降解細菌一樣,P.putida ND6的萘降解基因位于一個10,1858 bp的大質粒pND6-1上,此質粒已被測序和注釋。序列分析表明P.putida ND6的萘降解基因排列及降解途徑都與其它經典的萘降解菌株相似,上游操縱子(nah操縱子)包括nahAaAbAcAdBFCED

2、,編碼將萘轉變?yōu)樗畻钏崴璧拿?下游操縱子(sal操縱子)包括nahGTHINLOMKJY,編碼水楊酸經由兒茶酚間位裂解途徑生成乙酰乙醛和丙酮酸所需的酶。
　　 P.putida ND6的獨特之處在于在經典的萘降解操縱子之外有兩個額外的萘降解基因,既水楊醛脫氫酶基因nahF的同工基因nahV和水楊酸羥化酶基因nahG的同工基因nahU。本論文主要研究了其中水楊醛脫氫酶同工酶NahV的生物學功能和轉錄調控方式。
　　 質粒

3、拷貝數(shù)(Plasmid copy number,,PCN)是指每個細菌細胞中所含質粒的個數(shù)。P.putida ND6的萘降解基因位于大質粒。pND6-1上。應用實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法測定了萘降解菌株P.putida ND6中萘降解質粒pND6-1的拷貝數(shù)為2。
　　 通過自殺載體基因敲除的方法,分別構建了nahF和nahV基因突變株ND6-△△F和ND6-△△V。對比

4、了野生型ND6與基因敲除菌株ND6-△△F和ND6-△△V在生長和萘降解速率方面的不同,發(fā)現(xiàn)不論ND6-△△F還是ND6-△△V的萘降解速率與野生型ND6相比都有所降低;在mRNA和蛋白表達水平上,在nahF(或nahV)基因突變株ND6-△△F(或ND6-△△V)中,另一基因nahV(或nahF)的表達量都比野生型高;在水楊醛脫氫酶活性方面,無論以何種碳源培養(yǎng),野生型ND6的水楊醛脫氫酶活性都比基因突變株高。以上結果表明,雖然NahF

5、的水楊醛脫氫酶活性比NahV高,但萘降解菌株P.putida ND6中額外的水楊醛脫氫酶NahV的存在增加了細胞中水楊醛脫氫酶的劑量,從而加快了萘降解的速率;NahV能作為經典水楊醛脫氫酶NahF的后備和補充,當經典水楊醛脫氫酶基因nahF在細菌的進化過程中發(fā)生突變或缺失后,NahV能部分取代NahF的作用,行使水楊醛脫氫酶的功能,使得突變株能繼續(xù)生存。
　　 構建了nahR基因突變株ND6-△△R,對比了突變株與野生株中Nah

6、F和NahV在mRNA及酶活性水平的差異。無論以何種碳源培養(yǎng),誘導物水楊酸鈉是否存在時,P.putida ND6中的nahR基因都有一定量的本底表達,當加入誘導物水楊酸鈉時,nahR基因的表達量增加;P.putida ND6菌株中的水楊醛脫氫酶基因nahF和nahV都不是組成型表達(以葡萄糖為唯一碳源時,檢測不到它們的表達)。只有當誘導物水楊酸鈉和調節(jié)蛋白NahR同時存在,水楊酸鈉與NahR相結合,才能使RNA聚合酶I結合于啟動子的正確