萘降解菌株P(guān)eseudomonas putida ND6中水楊醛脫氫酶NahV的生物學(xué)功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、萘降解菌株P(guān)seudomonas putida ND6分離自天津市南排污河,是一株高效降解萘的菌株,能在48 h內(nèi)降解培養(yǎng)基中98％的萘(2 g/L)。同大部分萘降解細(xì)菌一樣,P.putida ND6的萘降解基因位于一個(gè)10,1858 bp的大質(zhì)粒pND6-1上,此質(zhì)粒已被測(cè)序和注釋。序列分析表明P.putida ND6的萘降解基因排列及降解途徑都與其它經(jīng)典的萘降解菌株相似,上游操縱子(nah操縱子)包括nahAaAbAcAdBFCED

2、,編碼將萘轉(zhuǎn)變?yōu)樗畻钏崴璧拿?下游操縱子(sal操縱子)包括nahGTHINLOMKJY,編碼水楊酸經(jīng)由兒茶酚間位裂解途徑生成乙酰乙醛和丙酮酸所需的酶。
　　 P.putida ND6的獨(dú)特之處在于在經(jīng)典的萘降解操縱子之外有兩個(gè)額外的萘降解基因,既水楊醛脫氫酶基因nahF的同工基因nahV和水楊酸羥化酶基因nahG的同工基因nahU。本論文主要研究了其中水楊醛脫氫酶同工酶NahV的生物學(xué)功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式。
　　 質(zhì)粒

3、拷貝數(shù)(Plasmid copy number,,PCN)是指每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含質(zhì)粒的個(gè)數(shù)。P.putida ND6的萘降解基因位于大質(zhì)粒。pND6-1上。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法測(cè)定了萘降解菌株P(guān).putida ND6中萘降解質(zhì)粒pND6-1的拷貝數(shù)為2。
　　 通過(guò)自殺載體基因敲除的方法,分別構(gòu)建了nahF和nahV基因突變株ND6-△△F和ND6-△△V。對(duì)比

4、了野生型ND6與基因敲除菌株ND6-△△F和ND6-△△V在生長(zhǎng)和萘降解速率方面的不同,發(fā)現(xiàn)不論ND6-△△F還是ND6-△△V的萘降解速率與野生型ND6相比都有所降低;在mRNA和蛋白表達(dá)水平上,在nahF(或nahV)基因突變株ND6-△△F(或ND6-△△V)中,另一基因nahV(或nahF)的表達(dá)量都比野生型高;在水楊醛脫氫酶活性方面,無(wú)論以何種碳源培養(yǎng),野生型ND6的水楊醛脫氫酶活性都比基因突變株高。以上結(jié)果表明,雖然NahF

5、的水楊醛脫氫酶活性比NahV高,但萘降解菌株P(guān).putida ND6中額外的水楊醛脫氫酶NahV的存在增加了細(xì)胞中水楊醛脫氫酶的劑量,從而加快了萘降解的速率;NahV能作為經(jīng)典水楊醛脫氫酶NahF的后備和補(bǔ)充,當(dāng)經(jīng)典水楊醛脫氫酶基因nahF在細(xì)菌的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生突變或缺失后,NahV能部分取代NahF的作用,行使水楊醛脫氫酶的功能,使得突變株能繼續(xù)生存。
　　 構(gòu)建了nahR基因突變株ND6-△△R,對(duì)比了突變株與野生株中Nah

6、F和NahV在mRNA及酶活性水平的差異。無(wú)論以何種碳源培養(yǎng),誘導(dǎo)物水楊酸鈉是否存在時(shí),P.putida ND6中的nahR基因都有一定量的本底表達(dá),當(dāng)加入誘導(dǎo)物水楊酸鈉時(shí),nahR基因的表達(dá)量增加;P.putida ND6菌株中的水楊醛脫氫酶基因nahF和nahV都不是組成型表達(dá)(以葡萄糖為唯一碳源時(shí),檢測(cè)不到它們的表達(dá))。只有當(dāng)誘導(dǎo)物水楊酸鈉和調(diào)節(jié)蛋白NahR同時(shí)存在,水楊酸鈉與NahR相結(jié)合,才能使RNA聚合酶I結(jié)合于啟動(dòng)子的正確