中國野生葡萄醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化歐洲無核葡萄的研究.pdf

1、本研究以“紅寶石無核”、“長穗無核白”和“紅臉無核”為材料，從器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑建立無核葡萄遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，將連接在表達載體pWR306的中國野生葡萄醛脫氫酶相關基因(ALDH)導入農(nóng)桿菌中，進行農(nóng)桿菌介導的葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系及轉(zhuǎn)基因葡萄檢測的研究，取得的主要結果如下： 1.以“紅寶石無核”和“長穗無核白”葡萄的試管苗葉片、葉柄及莖段為材料，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對兩個葡萄品種葉片、葉柄和莖段不定芽再生的影響。結果表

2、明，誘導“紅寶石無核”葉片不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為MS+TDZ2.0mg/L+NAA0.1mg/L，再生率為33.33％；“長穗無核白”葉片、葉柄不定芽再生的最佳培養(yǎng)基均為MS+BAP5.0mg/L+NAA0.5mg/L，再生率分別為25％和30.01％；“紅寶石無核”的葉柄不定芽再生率遠遠低于其葉片?！凹t寶石無核”和“長穗無核白”莖段不定芽再生率都較低，最高分別為5.22％和2.78％。不定芽伸長的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+BAP1.0

3、mg/L+IBA0.5mg/L。再生植株的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L。 2.以“紅臉無核”花藥、子房為材料，研究胚狀體發(fā)生途徑的再生。結果表明：花藥胚性愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+BAP0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L，誘導率為60％；子房胚性愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+BAP1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L，誘導率為25％。胚性愈傷組織接種在不含2,4-D的原培養(yǎng)基上誘導出胚狀體，花藥

4、胚狀體的誘導率為84.67％，子房胚狀體的誘導率為41.67％。無激素的MS培養(yǎng)基是胚狀體增殖和萌發(fā)的培養(yǎng)基；最佳的成苗培養(yǎng)基為WPM+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L，成苗率為64.0％。 3.含醛脫氫酶相關基因(ALDH)的農(nóng)桿菌GV3101作為轉(zhuǎn)化侵染菌液。通過器官發(fā)生途徑和胚狀體發(fā)生途徑，獲得抗性再生葡萄植株。進行ALDH基因的PCR檢測，結果表明：侵染“紅寶石無核”葉片獲得了17個株系的抗性再生植株，獲得1個株系的

5、PCR陽性植株，PCR檢測轉(zhuǎn)化率為5.88％；轉(zhuǎn)化“長穗無核白”的葉柄獲得了18個株系的抗性再生植株，PCR檢測出3個陽性植株，陽性率為16.67％。侵染“長穗無核白”的葉柄愈傷獲得66個株系的抗性再生植株，PCR檢測出16個株系的陽性植株，轉(zhuǎn)化率為24.24％；侵染“紅臉無核”胚性愈傷組織，獲得9個株系的抗性再生植株；侵染“紅臉無核”胚狀體，獲得了102個株系的抗性再生植株，隨機選取了30個株系進行PCR檢測，有16個株系是陽性植株，

6、陽性率為53.33％。實驗中胚狀體發(fā)生途徑獲得的“紅臉無核”葡萄的抗性再生率最高，PCR檢測陽性率也較高。 4.“長穗無核白”關于ALDH基因的PCR檢測呈陽性的6個轉(zhuǎn)化株系，進行HPTⅡ基因的PCR檢測全是陽性植株?！伴L穗無核白”關于ALDH基因的PCR檢測呈陰性的16個株系，進行HPTⅡ基因的PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有2株是陽性植株。 5.“長穗無核白”的5個PCR陽性株系進行HPTⅡ基因的PCR-Southern檢測，結果