人參皂苷Rg1調(diào)控FoxO3a相關(guān)信號(hào)通路抑制人臍血源基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究.pdf

1、造血微環(huán)境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞（haemopoietic stem cells,HSCs）生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，其結(jié)構(gòu)和功能的完整是維系正常造血功能的重要因素?；|(zhì)細(xì)胞作為HIM的核心組分，不僅通過(guò)形成HSCs生長(zhǎng)發(fā)育的“龕”、分泌造血因子和細(xì)胞外基質(zhì)等方式支持和調(diào)控HSCs自我更新與分化，還與多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。本課題組長(zhǎng)

2、期從事人臍血源基質(zhì)細(xì)胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及臍血造血微環(huán)境的研究。我們的前期體外研究證實(shí)hUCBDSCs具有造血基質(zhì)細(xì)胞的基本生物學(xué)特征，能有效支持臍血CD34+細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，hUCBDSCs與造血細(xì)胞聯(lián)合移植于輻照后裸鼠體內(nèi)具有促進(jìn)造血重建、修復(fù)受損微環(huán)境和減輕移植物抗宿主?。℅VHD,graft-versus-host

3、disease）的多重效應(yīng)。
　　然而隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs存在移植后存活狀況差和植入效率較低等問(wèn)題，分析主要原因可能是在體外培養(yǎng)和體內(nèi)輸注過(guò)程中會(huì)面臨營(yíng)養(yǎng)缺乏、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等多種不良因素刺激。這些因素導(dǎo)致胞內(nèi)自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能失調(diào)，進(jìn)而造成細(xì)胞衰老、死亡或凋亡。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源，也是最先被攻擊的細(xì)胞器。線粒體R

4、OS（mitochondrial ROS,mtROS）的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是維系線粒體和細(xì)胞正常功能的關(guān)鍵所在。線粒體氧化應(yīng)激，即mtROS的產(chǎn)生與抗氧化防御之間的不平衡，將導(dǎo)致線粒體功能障礙及一系列相關(guān)疾病。為確保hUCBDSCs活力和移植療效，研究如何提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化保護(hù)功能和維持mtROS穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的有效途徑具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景意義。
　　人參是中醫(yī)臨床“補(bǔ)氣要藥”，已有數(shù)千年的臨床用藥歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，人參皂苷是人參

5、中主要的藥理學(xué)活性成分，有多達(dá)幾十種皂苷，人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1,G-Rg1）是其中最重要的單體皂苷成分之一。本課題組和其他學(xué)者的研究證實(shí)，人參皂苷 Rg1在抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老、抗糖尿病、抗神經(jīng)原退化和促干/祖細(xì)胞增殖等方面有廣泛藥理學(xué)作用。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有拮抗氧化致衰劑對(duì)多種器官和細(xì)胞的氧化損傷與促細(xì)胞凋亡作用，提示人參皂苷Rg1是人參中重要的抗氧化皂苷。課題組既往研究證明，人參皂苷 R

6、g1不僅能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）增殖分化與造血生長(zhǎng)因子分泌，還能通過(guò)增強(qiáng)其在D-半乳糖誘導(dǎo)的應(yīng)激條件下的抗氧化和抗炎能力以延緩細(xì)胞衰老。然而，人參皂苷Rg1是否對(duì)于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的hUCBDSCs損傷與凋亡發(fā)揮一定的保護(hù)作用以及可能的分子機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　目的：在本研究中，我們體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增hUCBDSCs，并采用叔丁基過(guò)氧化氫（tert-butyl hydr

7、operoxide,t-BHP）損傷hUCBDSCs構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，研究人參皂苷Rg1拮抗hUCBDSCs氧化損傷、促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制凋亡以及維持線粒體ROS穩(wěn)態(tài)的重要作用，深入探索轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子叉頭框蛋白O3a（Fokhead box O3a,FoxO3a）介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在人參皂苷Rg1發(fā)揮這些效應(yīng)中的作用。旨在為闡釋人參皂苷Rg1抗氧化效應(yīng)的現(xiàn)代分子生物學(xué)機(jī)制提供新的理論依據(jù)；為提高h(yuǎn)UCBDSCs臨床移植治療效果提供新

8、的輔助手段。
　　方法：
　　1．體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增hUCBDSCs，采用t-BHP處理細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷體外模型。分別以不同濃度人參皂苷Rg1處理?yè)p傷后的hUCBDSCs，CCK-8法檢測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)hUCBDSCs細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖的影響，在倒置相差顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞集落形成單位（colony-forming unit of fibroblast,CFU-F）的形成。以試劑盒分別檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，包括丙二

9、醛（malondialdehyde,MDA）含量，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活力。
　　2．采用不同濃度人參皂苷Rg1分別處理t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，闡明人參皂苷Rg1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Western blot法檢測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs凋亡相關(guān)蛋白（Caspas

10、e-3、Bim、Bax和Bcl-2）表達(dá)水平的影響。Western blot法檢測(cè)Akt-FoxO3a信號(hào)通路在人參皂苷Rg1下調(diào)Bim蛋白表達(dá)水平中的作用，Western blot法檢測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)FoxO3a在hUCBDSCs中胞核/質(zhì)轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)作用。
　　3．采用不同濃度人參皂苷Rg1處理t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs，激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope, LSC

11、M）分別檢測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)總ROS和mtROS生成的影響，利用LSCM檢測(cè)人參皂苷 Rg1對(duì) t-BHP誘導(dǎo)的 hUCBDSCs線粒體膜電位（MMP, mitochondrial membrane potential）的影響。以試劑盒檢測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)錳超氧化物岐化酶（Mn-SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase）活力的影響。采用CCK-8法、LSCM和相應(yīng)試劑盒檢測(cè)等方法明確Sirt1在人參皂苷Rg1阻抑線粒體氧化損傷中的作用，W

12、estern blot法檢測(cè)AMPK-Sirt1信號(hào)通路在人參皂苷Rg1上調(diào)FoxO3a去乙?；街械淖饔?。
　　結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建t-BHP誘導(dǎo)hUCBDSCs的氧化應(yīng)激損傷體外模型
　　研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度t-BHP損傷hUCBDSCs后，細(xì)胞存活率隨t-BHP濃度的增加而逐漸降低。在t-BHP濃度（80μM）處理細(xì)胞6h時(shí)，細(xì)胞存活率降至（52±3.10）%，即IC50約為80μM。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以80

13、μM劑量t-BHP處理細(xì)胞6h的方法構(gòu)建t-BHP誘導(dǎo)hUCBDSCs的氧化應(yīng)激損傷體外模型。
　　2．人參皂苷Rg1抑制t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs損傷和凋亡
　?。?）在本研究涉及的濃度范圍內(nèi)，人參皂苷Rg1能濃度依賴的抑制t-BHP誘導(dǎo)hUCBDSCs的活力下降，當(dāng)人參皂苷Rg1濃度為0.1、1、10和50μM時(shí)作用最為顯著。人參皂苷Rg1（50μM）還對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖下降和CFU-F形成減少具有明顯的恢

14、復(fù)作用，且對(duì)于正常hUCBDSCs也具有一定促增殖作用。
　　（2）t-BHP損傷hUCBDSCs后MDA含量和LDH酶活性顯著上升，而SOD酶活性明顯降低。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理均能顯著降低MDA和LDH水平；當(dāng)濃度為10μM和50μM時(shí)人參皂苷Rg1還能明顯提高SOD的酶活性。
　?。?）t-BHP損傷hUCBDSCs后凋亡率較正常組顯著增加，而不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理均

15、能夠有效抑制t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs凋亡。人參皂苷Rg1（50μM）還能顯著抑制促凋亡蛋白酶Caspase-3的活化、降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表達(dá)及提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。
　　3．Akt-FoxO3a-Bim信號(hào)通路在人參皂苷Rg1抑制凋亡中的作用
　　人參皂苷Rg1（50μM）能激活A(yù)kt和FoxO3a磷酸化，促進(jìn)FoxO3a由胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，這一改變抑制了FoxO3a對(duì)下游凋亡誘導(dǎo)基因Bim的表達(dá)

16、調(diào)控，進(jìn)而下調(diào)了促凋亡蛋白Bim和Bax的表達(dá)，并上調(diào)了抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。而人參皂苷Rg1作用能被PI3K抑制劑LY29004所抑制，提示Akt-FoxO3-Bim信號(hào)通路在人參皂苷Rg1阻抑t-BHP誘導(dǎo)hUCBDSCs的凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　4．人參皂苷Rg1減輕t-BHP誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，t-BHP損傷hUCBDSCs后DCFH-DA熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯升高

17、，提示胞內(nèi)總ROS水平上升。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理細(xì)胞后總ROS水平隨著人參皂苷Rg1濃度增加而逐漸下降，表明人參皂苷Rg1能抑制t-BHP誘導(dǎo)的胞內(nèi)活性氧水平提升。
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，t-BHP損傷hUCBDSCs后MitoSOX Red紅色熒光變強(qiáng)，線粒體O2·-水平明顯升高。人參皂苷Rg1濃度依賴的抑制t-BHP誘導(dǎo)的線粒體O2·-增加，當(dāng)其濃度為10μM和50μM時(shí)，O2·-

18、水平顯著低于t-BHP單處理組，提示人參皂苷Rg1具有降低線粒體活性氧水平的作用。
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡觀察JC-1探針標(biāo)記的hUCBDSCs，并采用紅/綠色熒光強(qiáng)度的比值代表線粒體膜電位（Δψm）。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，t-BHP處理細(xì)胞后Δψm明顯降低。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理細(xì)胞后Δψm隨人參皂苷Rg1濃度增加而逐漸增加，提示人參皂苷Rg1能抑制t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs線粒體膜

19、電位丟失。
　?。?）t-BHP損傷hUCBDSCs后導(dǎo)致Mn-SOD和Catalase的酶活力下降，而人參皂苷Rg1處理能濃度依賴的提高這兩種線粒體抗氧化酶的活力。當(dāng)人參皂苷Rg1濃度為10μM和50μM時(shí)，Mn-SOD酶活力水平顯著高于t-BHP單處理組；人參皂苷Rg1濃度為1、10和50μM時(shí)，Catalase酶活力較t-BHP單處理組有顯著提高。結(jié)果提示人參皂苷Rg1可通過(guò)提高M(jìn)n-SOD和Catalase酶活力發(fā)揮線粒體

20、抗氧化作用。
　　5．AMPK-Sirt1-FoxO3a信號(hào)通路在人參皂苷Rg1調(diào)控線粒體活性氧水平中的作用
　?。?）人參皂苷Rg1（50μM）能顯著提高t-BHP誘導(dǎo)的hUCBDSCs細(xì)胞Sirt1的表達(dá)水平，且對(duì)于正常細(xì)胞Sirt1的表達(dá)也有促進(jìn)作用。使用Sirt1的siRNA干擾后，人參皂苷Rg1對(duì)線粒體O2·-生成的抑制作用被明顯減弱，Mn-SOD和Catalase酶活性降低，細(xì)胞活力也隨之下降，提示Sirt1活化

21、對(duì)于人參皂苷Rg1發(fā)揮線粒體抗氧化作用是必要的。（2）t-BHP損傷hUCBDSCs后磷酸化的AMPK、Sirt1表達(dá)及去乙?；?FoxO3a表達(dá)水平均明顯降低。與 t-BHP處理組比較，人參皂苷Rg1（50μM）能顯著促進(jìn)AMPK磷酸化激活和上調(diào)Sirt1表達(dá)水平，進(jìn)而提高FoxO3a去乙?；?。分別利用AMPK siRNA和Sirt1 siRNA干擾處理后，人參皂苷Rg1這一系列效應(yīng)被抑制，表明人參皂苷Rg1能夠通過(guò)激活A(yù)MPK

22、-Sirt1信號(hào)通路促進(jìn)FoxO3a去乙?；?，進(jìn)而上調(diào)FoxO3a介導(dǎo)的Mn-SOD和Catalase兩種酶的表達(dá),發(fā)揮線粒體活性氧清除作用。
　　結(jié)論：
　　1．人參皂甙Rg1能夠促進(jìn)t-BHP誘導(dǎo)hUCBDSCs的存活、提高增殖能力，并通過(guò)調(diào)控Akt-FoxO3a-Bim信號(hào)通路在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　2．人參皂苷Rg1通過(guò)清除過(guò)多mtROS來(lái)保護(hù)hUCBDSCs免受t-BHP誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷，