人參皂苷Rg1拮抗致衰劑致骨髓基質(zhì)細(xì)胞衰老作用及機(jī)理研究.pdf

1、背景：衰老生物學(xué)與延緩衰老是社會(huì)科學(xué)和自然科學(xué)共同關(guān)注的重大研究課題。2014年國家統(tǒng)計(jì)局公布數(shù)據(jù)顯示，中國總?cè)丝跒?3.6億人,其中年齡超過60歲者達(dá)2.02億，占14.9％，到2020年，中國將進(jìn)入超級老齡化國家。面臨世界和我國人口老化進(jìn)程加快和人們壽命普遍提高的趨勢，確保老年人享有健康和高質(zhì)量生活已成為社會(huì)科學(xué)和生命科學(xué)共同關(guān)注重大問題。因此加快推動(dòng)衰老生物學(xué)與延緩衰老的研究有重要科學(xué)意義及社會(huì)價(jià)值。
　　最新研究表明，機(jī)體

2、干細(xì)胞衰老是生物個(gè)體衰老最直接和根本原因。因此，尋找調(diào)控與延緩干細(xì)胞衰老途徑，闡述其現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理對延緩人體衰老和防治老年性疾病具有重要意義。我們前期工作證明，造血系統(tǒng)功能衰退與造血干細(xì)胞（HSCs）衰老密切相關(guān)，采用中醫(yī)學(xué)“補(bǔ)氣生血”途徑可以延緩HSCs衰老?，F(xiàn)代血液學(xué)理論認(rèn)為，血細(xì)胞發(fā)生是指HSCs在造血誘導(dǎo)微環(huán)境（HIM）的精密調(diào)控下生成與釋放血細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡過程。HIM是HSCs賴以生長發(fā)育微環(huán)境，HIM的核心成分是骨髓基質(zhì)細(xì)胞

3、（BMSCs），它包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和血竇內(nèi)皮細(xì)胞等，它們不僅為造血細(xì)胞生長發(fā)育提供支架，而且能分泌多種造血生長因子調(diào)控造血細(xì)胞增殖與分化。可見，BMSCs的生物學(xué)特點(diǎn)直接反映造血微環(huán)境功能狀態(tài)。HSCs衰老與HIM功能狀態(tài)密切相關(guān)，闡述HSCs衰老機(jī)制和尋找延緩 HSCs途徑必然離不開對BMSCs功能的研究。
　　人參是中醫(yī)臨床“補(bǔ)氣”要藥，人參皂苷是其主要的藥物成分。課題組前期研究表明，人參皂苷

4、Rg1是人參重要的抗衰老成分，它能拮抗致衰劑對HSC的致衰作用，能使細(xì)胞體外生存壽命延長，給衰老大鼠注射人參皂苷Rg1可阻止致衰劑對骨髓造血細(xì)胞損傷。人參皂苷Rg1能否通過調(diào)控骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的功能，進(jìn)而延緩HSCs衰老還尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　目的:
　　本研究通過建立D-半乳糖致大鼠衰老模型和BMSCs體外衰老模型，探討人參皂苷Rg1拮抗致衰劑對BMSCs體內(nèi)外衰老作用及其生物學(xué)機(jī)理，旨在闡釋人參抗衰老成分調(diào)控BM

5、SCs功能與延緩造血細(xì)胞衰老的機(jī)理，為尋找延緩造血微環(huán)境衰老新途徑提供理論與實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性；密度梯度離心法分離骨髓BMNCs，貼壁培養(yǎng)4h后，收集上層懸浮BMNCs。
　　2.通過衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色，CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測、電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法觀察D-gal對BMSCs衰老生物學(xué)指標(biāo)

6、的影響，以建立D-gal體外誘導(dǎo)BMSCs衰老模型。
　　3.將懸浮BMNCs與衰老BMSCs共培養(yǎng)，應(yīng)用SA-β-Gal染色，CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測，CFU-Mix混合集落形成能力檢測的方法觀察衰老BMSCs對BMNCs衰老生物學(xué)指標(biāo)及造血功能的影響，
　　4.Rg1與D-gal共培養(yǎng)BMSCs，應(yīng)用SA-β-Gal染色，透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測，酶學(xué)免疫法培養(yǎng)上清中IL-

7、2、IL-6、TNF-α、GM-CSF、SCF、IL-1β分泌水平，DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度，WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力，TBA法檢測胞內(nèi)MDA含量，Western blot檢測P53、P21、P16、CDK2、CDK4、cyclinD、cyclinE的方法，從BMSCs衰老生物學(xué)特點(diǎn)、氧化與抗氧化指標(biāo)、細(xì)胞因子表達(dá)水平、衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的角度觀察Rg1拮抗BMSCs衰老機(jī)理。

8、　　5.Rg1與D-gal作用BMSCs后與BMNCs共培養(yǎng)，應(yīng)用SA-β-Gal染色，CFU-Mix混合集落形成能力，CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測，DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度，WST-8法檢測胞內(nèi)SOD活力，TBA法檢測MDA含量，從BMNCs衰老生物學(xué)特點(diǎn)、氧化與抗氧化指標(biāo)、細(xì)胞因子分泌水平的改變?nèi)矫嬗^察Rg1拮抗BMSCs后對BMNCs衰老抑制作用及其促進(jìn)BMNCs增殖分化及

9、造血功能恢復(fù)的機(jī)理。
　　6.大鼠皮下注射D-gal建立衰老大鼠衰老體內(nèi)模型，分離純化BMSCs及BMNCs后，應(yīng)用SA-β-Gal染色、CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老生物學(xué)指標(biāo)。
　　7.應(yīng)用SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細(xì)胞周期檢測的方法觀察衰老大鼠體內(nèi)BMNCs衰老生物學(xué)指標(biāo)。
　　8.人參皂苷Rg1注射衰老大鼠，分離純化BMSCs及BMNCs后，應(yīng)用

10、SA-β-Gal染色、CCK8比色法、細(xì)胞周期及凋亡率檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi)ROS含量，酶免疫法檢測培養(yǎng)上清液中水平氧化損傷指標(biāo) MDA、SOD、GSH-Px及細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、TNF-α、SCF、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16、CDK2及cyclinD表達(dá)水平的方法從衰老生物學(xué)指標(biāo)、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達(dá)的方面觀察Rg1拮抗衰老大鼠體內(nèi)BMSCs衰老的機(jī)理。
　　9.應(yīng)用

11、SA-β-Gal染色、CFU-Mix混合集落檢測、細(xì)胞周期檢測、DCFH-DA熒光法檢測胞內(nèi) ROS水平、WST-8檢測胞內(nèi)SOD活力、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達(dá)水平的方法，并結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從衰老生物學(xué)指標(biāo)、慢性炎癥、氧化損傷及衰老蛋白表達(dá)的角方面觀察Rg1處理衰老大鼠后，體內(nèi)BMNCs衰老延緩及其造血功能恢復(fù)的可能機(jī)理及其與BMSCs的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)純化后的BMSC

12、s，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞率為：（96±0.68）%，表明貼壁培養(yǎng)純化后的BMSCs具有良好的生物學(xué)特點(diǎn)。
　　2.D-gal作為致衰劑在體外能誘導(dǎo)BMSCs呈現(xiàn)典型的衰老生物學(xué)表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率升高，透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)典型衰老形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：細(xì)胞質(zhì)深染、線粒體空泡變性、細(xì)胞膜形態(tài)改變，CCK8檢測細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞周期G1期增加、S期減少，細(xì)胞凋亡率增加，胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加，激光共聚焦

13、觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞上清液中IL-2、TNF-α升高，IL-6、SCF、GM-CSF、IL-1β降低，胞內(nèi)P53、P21、P16表達(dá)水平升高，CDK2、CDK4及cyclinD表達(dá)減少，而cyclinE表達(dá)水平無明顯改變。
　　3.衰老BMSCs與BMNCs體外共培養(yǎng)，BMNCs呈現(xiàn)衰老的生物學(xué)表現(xiàn)：SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率升高，CFU-Mix形成能力減弱，CCK8檢測細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞周期G1期增加、S

14、期減少，細(xì)胞凋亡率增加，胞內(nèi)SOD活力降低、ROS及MDA水平增加，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。
　　4.Rg1體外作用衰老BMSCs可降低其SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率，增加CCK8細(xì)胞增殖能力，降低透射電鏡觀察到細(xì)胞衰老形態(tài)學(xué)改變減輕，提升S期細(xì)胞率，降低G1期細(xì)胞，降低細(xì)胞凋亡率，提升胞內(nèi)SOD活力、降低ROS及MDA水平，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯減弱，細(xì)胞上清液中IL-2、TNF-α減少，IL-

15、6、SCF、GM-CSF、IL-1β水平升高，胞內(nèi)P53、P21、P16表達(dá)水平降低，CDK2、CDK4表達(dá)上升，cyclinD及cyclinE表達(dá)水平無明顯改變。
　　5. Rg1體外作用衰老BMSCs與 BMNCs共培養(yǎng)后，與衰老組BMNCs比較，SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率降低，CFU-Mix形成能力增強(qiáng)，CCK8檢測細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞周期 G1期減少、S期增加，細(xì)胞凋亡率減少，胞內(nèi)SOD活力提升、ROS水平降低而MD

16、A水平無明顯改變，激光共聚焦觀察胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　6.衰老大鼠BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加、CCK8細(xì)胞增殖能力減弱、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例減少、G1期比例增加，凋亡率明顯增加，胞內(nèi)ROS、MDA水平升高SOD、GSH-Px水平降低、IL-2、TNF-α分泌水平減少、IL-6、SCF分泌水平增加，Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16增加，CDK2表達(dá)減少，而cyclinD水平無

17、明顯改變。
　　7.衰老大鼠BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯增加、CFU-Mix混合集落形成能力減弱、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例減少，G1期細(xì)胞比例增加，ROS水平增加、SOD活力降低、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達(dá)水平增加。
　　8. Rg1作用衰老大鼠后，體內(nèi)BMSCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯減少、CCK8細(xì)胞增殖能力增加、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例增加、G1期比例降低，凋亡率明顯減少，

18、ROS、MDA水平減少，SOD活力增加但GSH-Px水平無明顯改變、IL-2、TNF-α分泌水平增加、IL-6、SCF水平減少，Western blot檢測胞內(nèi)P53、P21、P16表達(dá)減少，CDK2與cyclinD水平無明顯改變。
　　9.Rg1作用衰老大鼠后，體內(nèi)BMNCs的SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞率明顯減少、CFU-Mix混合集落形成能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例增加，G1期細(xì)胞比例減少，ROS水平減少、SOD活力增加、

19、Western blot檢測胞內(nèi)P53、P16表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.D-gal可以復(fù)制BMSCs衰老的體內(nèi)外模型。
　　2.衰老的BMSCs可誘導(dǎo)BMNCs衰老。
　　3.人參皂苷Rg1在體內(nèi)外均可拮抗D-gal對BMSCs的致衰作用，并通過以上途徑恢復(fù)BMNCs的造血能力。。
　　4.人參皂苷Rg1拮抗D-gal對BMSC的致衰作用可能與抑制氧化應(yīng)激損傷、抑制炎性反應(yīng)、下調(diào)衰老相關(guān)蛋白有關(guān)。