dmt1的高表達在mes23.5細胞鐵聚積中的作用及人參皂苷rg1的保護作用機制研究

1、青島大學博士學位論文DMT1的高表達在MES23.5細胞鐵聚積中的作用及人參皂苷Rg1的保護作用機制研究姓名：徐華敏申請學位級別：博士專業(yè)：生理學指導(dǎo)教師：謝俊霞200805262 ．應(yīng)用R T - P C R 的方法從人胚近段小腸中獲取人的全長D M T Ie D N A ，包括+ I R E 型和．I R E 型，測序結(jié)果正確。利用細菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建了攜帶D M T l 編碼基因的重組腺病毒載體。經(jīng)P a c I 酶切鑒定和P

2、 C R 鑒定獲到重組腺病毒載體p A d E a s y l ·D M T I + I R E 和p A d E a s y l - D M T l 一I R E 。重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2 9 3 細胞成功制備了高滴度的重組腺病毒。3 ．重組腺病毒A d D M T I + I R E 或A d D M T l ．I R E 分別感染M E S 2 3 ．5 多巴胺能神經(jīng)細胞系，2 4h 后可觀察到綠色熒光蛋白( g r e

3、e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，G F P ) 的表達。W e s t e r n b l o t s 檢測到A d D M T I + I R E 感染的細胞D M T I + I R E 的蛋白水平較病毒對照組有明顯的增加；A d D M T l ．I R E 感染的細胞D M T l ．I R E 的蛋白水平較病毒對照組有明顯升高( P < O ．0 1 ) 。4 ．M T T

4、測定結(jié)果顯示A d D M T I + I R E 或A d D M T l ．I R E 感染的M E S 2 3 ．5 細胞在鐵孵育( 1 0 0I _ t m o l ／L ) 2 4 h 后，細胞存活率均明顯降低，較對照組有統(tǒng)計學意義釁0 ．0 5 ) 。5 ．細胞鐵含量檢測結(jié)果顯示A d D M T I + I R E 或A d D M T l ．I R E 感染的M E S 2 3 ．5 細胞鐵孵育( 1 0 0p ．m o

5、 l ／L F e S 0 4 ) 后細胞內(nèi)鐵含量均高于病毒對照組( 氏0 ．0 1 ) 。而細胞內(nèi)羥自由基和M D A 含量較病毒對照組有明顯的增加，差別有統(tǒng)計學意義( 尸< O ．0 1 ) 。6 ．M E S 2 3 ．5 細胞鐵孵育后檢測細胞凋亡包括c a s p a s e - 3 的活性，D N Al a d d e r 和H o e c h s t 染色，結(jié)果顯示A d D M T I + I R E 或A d D

6、M T l ．I R E 感染的M E S 2 3 ．5 細胞鐵孵育后c a s p a s e - 3 的活性明顯增加( 氏0 ．0 1 ) ，出現(xiàn)明顯的凋亡梯度帶和核固縮等凋亡的形態(tài)學變化( P < O ．0 5 ) 。7 ．H P L C 結(jié)果顯示A d D M T I + I R E 或A d D M T l ．I R E 感染的M E S 2 3 ．5 細胞鐵孵育后細胞內(nèi)多巴胺含量均較病毒對照組有明顯的降低( P <

7、; O ．0 5 ) 。8 ．p c D N A 3 ．1 - D M T I + I R E 和p c D N A 3 ．1 - D M T l - I R E 表達載體構(gòu)建成功，應(yīng)用熒光染料c a l c e i n 結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測了細胞的攝鐵功能，結(jié)果表明p c D N A 3 ．1 - D M T I + I R E 或p c D N A 3 ．1 - D M T l 一I R E 轉(zhuǎn)染的M E S 2 3 ．5