高鐵環(huán)境中DMT1對成骨細胞自噬作用機制的研究.pdf

1、隨著經濟的發(fā)展，人口平均壽命的延長，糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。自1990年到2010年，全球糖尿病患病率上升近4倍。我國是糖尿病大國，2007-2008年20歲以上人群糖尿病患病率為9.7％，2010年為9.65％。眾所周知，糖尿病的主要危害不在于其疾病的本身，而是其在全身各系統器官并發(fā)癥。近年，糖尿病相關的骨代謝、骨微結構的改變所致骨折風險增高引起醫(yī)學界的廣泛注意。
　　骨質疏松癥作為一種常見的代謝性骨病，其受到

2、遺傳的影響非常強。骨質疏松癥的主要特征是在骨組織中的骨量的減少和缺陷，進而削弱骨的強度并導致脆性骨折的風險增加。近三分之一婦女遭受著骨質疏松癥的影響，同時，在50歲以上男性中，其中每八個人就有一個遭受著骨質疏松癥的影響。由于骨量在成年期后就隨年齡逐漸減少，所以骨質疏松被公認為是老年人的常見疾病，由于在骨折發(fā)生時缺乏明顯的征兆，故又稱為沉默疾病。骨質疏松癥分為兩類:絕經后骨質疏松癥（1型骨質疏松癥），是絕經后的女性是最常見的疾病，與雌激素

3、缺乏相關;老年性骨質疏松癥（2型骨質疏松癥）與老齡化、膳食中鈣的缺乏、維生素D下降、甲狀旁腺的活動增加以及糖尿病等疾病密切相關。
　　鐵超載與骨質疏松之間的關系已得到證實。Weiss G等發(fā)現在血色素沉著癥中，伴隨鐵的過量沉積，63％的患者出現骨質疏松;Chen B等研究發(fā)現，鐵超載具有明顯的成骨抑制作用，而這種作用可以被鐵離子螯合劑去鐵胺所拮抗;Li GF等認為骨質疏松與鐵超載具有明顯的相關性。但鐵超載在糖尿病骨微結構改變中是否

4、起到主要作用，目前尚不明確。
　　在糖尿病及其相關并發(fā)癥中，糖基化終末產物(advanced glycosylation endprodrcts，AGEs)起到重要作用。研究發(fā)現，隨著2型糖尿病大鼠體內AGEs的增加，骨微結構可出現顯著變化。同時，AGEs可以導致成骨細胞內鐵離子超載。因此，我們推測糖尿病骨微結構改變與鐵離子超載密切相關，但在糖尿病骨微結構改變中，引起成骨細胞鐵超載的具體機制尚不明確。
　　二價金屬離子轉運體

5、1(divalent metal transporter1，DMT1)是哺乳類跨膜金屬離子轉運體。這種轉運體廣泛分布于人體各組織，其主要功能是介導細胞鐵吸收，以及參與鐵從內吞小體移位到胞漿的過程。DMT1的表達增加可以使細胞內鐵聚集，造成鐵超載。有研究證實糖尿病患者血糖濃度升高，可誘導成骨細胞表面DMT1的重新分布，使得成骨細胞表面的DMT1表達增高。但在2型糖尿病中，成骨細胞的鐵離子超載是否由DMT1過表達引起，還有待進一步研究。

6、r>　　鐵代謝對于維持機體正常功能，參與各種生化反應都發(fā)揮十分重要的作用。Chew KC等發(fā)現，在SH-SY5Y細胞（神經母細胞瘤細胞）中，由于DMT1的過表達，導致細胞內鐵離子增多，引起細胞自噬。因此，DMT1表達與鐵超載之間存在著緊密的聯系。同時，一些相關研究也表明了，鐵超載可以誘導細胞自噬和細胞凋亡。然而，從沒有研究報道表明，在成骨細胞中，通過DMT1的表達調節(jié)二價鐵離子的濃度從而影響細胞自噬，進而影響細胞凋亡。并且DMT1與自噬

7、的關系及具體機制仍不明確，有待進一步研究。
　　自噬是真核細胞降解并回收受損大分子和細胞器的主要代謝過程。在這一過程中，細胞內的蛋白或者受損的細胞器被有雙層結構膜的自噬體所吞噬，然后溶酶體與該膜性結構結合將其中的成分降解，并最終被利用于細胞的合成與代謝能力。在所有細胞中低水平的自噬可以確保長壽蛋白及細胞器穩(wěn)態(tài)的循環(huán)利用，并且在細胞遭受應激損傷的時候，細胞自噬可以被顯著的增強。最近的研究表明，自噬在骨生成中扮演一個復雜而重要的角色。

8、同時，細胞自噬與細胞凋亡密切相關。在有些情況下，自噬構成應激保護的作用從而抑制細胞凋亡，而在另一些情況下，自噬卻構成了另一種細胞死亡的通路。然而，在成骨細胞鐵過載如何影響自噬的病理機制仍不清楚。
　　因此，本課題主要通過研究DMT1對高鐵環(huán)境下成骨細胞自噬及凋亡的影響，觀察高鐵環(huán)境下成骨細胞自噬及凋亡的變化，探討DMT1對成骨細胞自噬的調控作用，及其對成骨細胞功能的影響。
　　方法:第一部分:利用MTT法檢測不同濃度不同時間

9、點FAC作用下對成骨細胞活力的影響;使用細胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細胞儀計數方法檢測高濃度FAC對成骨細胞凋亡的影響;使用PI單染流式細胞儀計數及;使用WesternBlot法檢測FAC作用下成骨細胞DMT1蛋白表達情況。
　　第二部分:利用MTT法檢測FAC作用下對成骨細胞活力的影響;使用WesternBlot法檢測FAC作用下成骨細胞自噬相關蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相關蛋白cleaved

10、 caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表達情況;使用透射電子顯微鏡觀察FAC作用下成骨細胞內自噬體數量;分別使用免疫熒光染色FAC作用下成骨細胞內源性LC3點簇狀聚集及DMT1表達情況;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨細胞，并刪選穩(wěn)定表達細胞株;使用細胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細胞儀計數方法檢測DMT1 shRNA作用下FAC對成骨細胞凋亡的影響;使用Western Blot法檢測DMT1 shRN

11、A作用下FAC對成骨細胞自噬相關蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相關蛋白cleaved caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表達情況。
　　第三部分:使用stubRFP-SensGFP-LC3慢病毒感染觀察FAC作用下成骨細胞自噬流的情況;使用Western Blot法檢測FAC對成骨細胞LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白以及JNK通路蛋白的影響;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨細胞，并刪

12、選穩(wěn)定表達細胞株;MTT法檢測DMT1 shRNA作用下FAC對成骨細胞活力的影響;使用細胞AnnexinⅤ-PE/7AAD雙染流式細胞儀計數方法檢測DMT1 shRNA作用下FAC對成骨細胞凋亡的影響;使用Western Blot法檢測DMT1 shRNA作用下FAC對成骨細胞自噬相關蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beelin-1以及JNK通路蛋白的影響;使用Western Blot檢測OPG、OCN蛋白的變化;使用茜素紅染色檢測FAC單獨

13、作用或與DMT1 shRNA聯合作用下對成骨細胞鈣結節(jié)數量的影響。
　　結果:第一部分:FAC對hFOB1.19細胞活力產生抑制作用:與對照組相比，FAC在300μmol/L作用12h、24h時可明顯抑制細胞活力，其中24h時作用最為明顯，細胞存活率約為50％;流式檢測不同濃度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于人成骨細胞hFOB1.1924小時，發(fā)現隨著FAC濃度的增加，與對照組細胞相比

14、細胞凋亡率顯著增加;流式周期檢測顯示:不同濃度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于hFOB1.19細胞24h后，發(fā)現隨著FAC濃度的增加，與對照組相比可以顯著的抑制S期hFOB1.19細胞的數量;FAC可以上調成骨細胞DMT1蛋白表達，且具有時間依賴性和濃度依賴性。
　　第二部分:我們發(fā)現，3-甲基腺嘌呤（3-MA）明顯地加強了在300μmol/L FAC作用24小時后FAC對hFOB1.

15、19細胞活力的抑制作用，這表明FAC對成骨細胞hFOB1.19活力的抑制與細胞自噬密切相關;同時，在300μmol/L FAC對hFOB1.19細胞處理24小時后DMT1表達明顯增高;之后，我們對成骨細胞hFOB1.19進行了DMT1 shRNA病毒轉染;此外，我們也發(fā)現通過抑制細胞自噬可以顯著的增加半胱氨酸蛋白酶途徑依賴的FAC誘導的細胞凋亡，但在DMT1 shRNA hFOB1.19細胞中半胱氨酸蛋白酶途徑依賴的FAC誘導的細胞凋亡

16、會被減弱;最后，我們的研究結果表明通過FAC的誘導可以使成骨細胞hFOB1.19內的自噬體增多，并且通過調控DMT1的表達可以減少這種細胞內自噬體積累的現象。
　　第三部分:首先，我們用stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒感染成骨細胞hFOB1.19，結果發(fā)現，FAC可以同時增加點簇狀黃色熒光(自噬體，GFP+/RFP+)及點簇狀紅色熒光（自噬溶酶體，GFP-/RFP+）聚集;其次，我們使用免疫印跡技術(westernbl

17、otting)和茜素紅染色來研究通過DMT1介導的成骨細胞hFOB1.19相關成骨功能指標，結果發(fā)現，通過抑制FAC誘導的細胞自噬可以顯著的抑制成骨細胞hFOB1.19OPG和OCN的表達并減少鈣結節(jié)的數量，但在加入DMT1 shRNA后，其成骨功能與FAC組相比明顯增強;之后，通過對JNK信號通路的研究我們發(fā)現，DMT1可以調節(jié)細胞內鐵離子濃度誘導的hFOB1.19細胞自噬進而影響細胞的成骨功能，而JNK信號通路在其中起到關鍵作用。<

18、br>　　結論:第一部分:FAC對成骨細胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用，且隨著FAC濃度的增高和作用時間的加長，其產生的抑制作用也隨之加強。同時，在FAC對成骨細胞hFOB1.19的增殖的抑制作用中DMT1可能在其中起到了至關重要的作用。
　　第二部分:在FAC對成骨細胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用中，自噬起到至關重要的作用;同時，FAC可以通過上調DMT1，從而增強成骨細胞內自噬體的聚集，促進細胞自噬，進而抑制細胞凋