人參皂苷Rg1改善氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)在臨床中發(fā)揮著重要作用，大量人工合成的GCs已廣泛用于治療自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、皮膚病和腫瘤等。GCs依賴糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)發(fā)揮其正常功能。長期大劑量應(yīng)用GCs，會(huì)導(dǎo)致GR數(shù)量及結(jié)合力下調(diào)，機(jī)體對GCs敏感性下降，繼而出現(xiàn)激素抵抗。
　　目前，越來越多的學(xué)者對GCs抵抗的原因及其機(jī)制展開了深入的研究，但是到目前為止，

2、對于GCs抵抗尚無非常有效的解決辦法，雖然出現(xiàn)了很多糖皮質(zhì)激素類替代藥物，如免疫抑制劑、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑、磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4，PDE4)抑制劑及細(xì)胞因子抑制劑等，但它們自身都有很大的局限性。
　　近年來，中醫(yī)藥在臨床中發(fā)揮著越來越重要的作用，許多學(xué)者致力于中醫(yī)藥改善GCs療效的研究。人參是中醫(yī)藥中重要的補(bǔ)益藥物，具有補(bǔ)氣固脫，健脾益肺，寧心益智，養(yǎng)血生津等功效。人參的主要活性成分為人參總皂苷(G

3、insenosides，GSS)，主要由原人參二醇及人參三醇組成，具有抗炎、抗腫瘤及緩解疲勞等作用。我們前期體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)GSS能夠逆轉(zhuǎn)地塞米松引起的GCs敏感性降低，改善大劑量激素引起的GR減少，而且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床研究中初步證實(shí)在不影響糖皮質(zhì)激素療效的前提下，GSS有助于減少GCs用量;通過上調(diào)GR，GSS能夠減輕肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后發(fā)熱、肝功能異常等不良反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GSS中的Rh1能夠通過調(diào)節(jié)GR改善長期大劑量使用GC

4、s后引起的激素抵抗，在體內(nèi)外增加GCs的抗炎作用，同時(shí)不會(huì)引起高血糖、骨質(zhì)疏松等糖皮質(zhì)激素常見的副作用，但具體機(jī)制還不清楚。除了哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、COPD等疾病，GCs還在皮膚病中廣泛運(yùn)用。為進(jìn)一步擴(kuò)大人參皂苷的臨床應(yīng)用范圍，本課題擬觀察人參皂苷聯(lián)合糖皮質(zhì)激素在炎癥類皮膚病中的應(yīng)用，并探討其可能機(jī)制。
　　多項(xiàng)研究顯示，人參皂苷本身具有抗氧化應(yīng)激作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1和Rh1可以顯著改善UVB照射引起的地塞米松（de

5、xamethasone，DEX）抵抗，但是其改善UVB引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的GCs抵抗的具體機(jī)理尚不清楚。核因子E2相關(guān)因子2（NF-E2 related factor2，Nrf2）是一種重要的氧化還原調(diào)節(jié)因子，其與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2位于細(xì)胞胞漿中，通過與它的細(xì)胞漿接頭蛋白keap1結(jié)合，錨定在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架;當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，PI3K-Akt信號通路活化，導(dǎo)致Nrf2磷酸化，磷酸化的Nrf2從Keap1-Nr

6、f2復(fù)合物中解離后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與氧化應(yīng)激反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游抗氧化基因如GPx、GCL及GST等的轉(zhuǎn)錄以對抗氧化應(yīng)激損傷。Sohal SS等研究發(fā)現(xiàn)吸煙煙霧里含有大量的氧化物質(zhì)，引起機(jī)體氧化應(yīng)激，下調(diào)HDAC2活性，引起GCs抵抗，其機(jī)制主要是氧化應(yīng)激后產(chǎn)生超氧化陰離子，其與硝化應(yīng)激反應(yīng)中生成的一氧化氮結(jié)合，生成過氧化亞硝酸鹽使得HDAC2上的酪氨酸殘基硝化，或者激活PI3K/AKT通路，使HDAC2的絲氨酸殘基磷酸

7、化，導(dǎo)致HDAC2蛋白酶體失活，使HDAC2活性下降。由此我們推測，人參皂苷可能通過調(diào)節(jié)Nrf2通路，抗氧化應(yīng)激，提高HDAC2表達(dá)及活性，增加GR的去乙?；剑M(jìn)而上調(diào)GR，從而改善UVB引起的GCs抵抗。GSS成份復(fù)雜，包含了上百種單體，僅商品化的人參皂苷單體就有40余種，如Rb1、Rb2、Rb3、Rg1、Rg2、Rg3、Rc、Rd、Re、Rf、Ro、Rh1、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、F1及F2等，這不利于其機(jī)制的研

8、究及臨床推廣。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rb1、Rh1、Rg1及Rb3均能夠明顯抑制DEX引起的GR下調(diào)，而糖皮質(zhì)激素抵抗與GR的表達(dá)密切相關(guān)。因此本研究試圖從Rb1、Rh1、Rg1及Rb3這4種人參皂苷但體中篩選出改善氧化應(yīng)激引起的GCs抵抗的最有效人參皂苷單體，然后進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
　　目的:觀察Rb1、Rh1、Rg1及Rb3這4種人參皂苷是否通過抑制氧化應(yīng)激改善糖皮質(zhì)激素抵抗，選出最效果最佳者并對其機(jī)制做初步探討。

9、
　　方法:
　　（一）篩選具有改善氧化應(yīng)激作用的人參皂苷單體，并觀察其在氧化應(yīng)激狀態(tài)下能否增強(qiáng)DEX的抗炎作用。
　　1.使用UVB和雙氧水(H2O2)兩種體外氧化應(yīng)激模型，篩選Rb1、Rh1、Rg1及Rb3單體中改善氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）最明顯的人參皂苷單體。
　　2.篩選在氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗模型中，輔助DEX抑制炎癥因子IL-6及IL-8分泌的最有效的人

10、參皂苷單體。
　　3.結(jié)合1及2中的結(jié)果，篩選出最佳人參皂苷單體，觀察其對MAPKs及NF-KB炎癥通路的影響。
　　（二）探討人參皂苷Rg1改善糖皮質(zhì)激素抵抗的作用機(jī)制。
　　1.探討Rg1是否通過抑制氧化應(yīng)激，抑制GR的乙?；?，進(jìn)而上調(diào)GR，改善GCs抵抗。
　　2.探討HDAC2在Rg1改善氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗中的作用。
　　3.探討Nrf2在Rg1改善氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗中的作用。<

11、br>　　（三）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察Rg1是否可以改善氧化應(yīng)激引起的糖皮質(zhì)激素抵抗。
　　建立Balb/c小鼠UVB照射性皮炎模型，將小鼠隨機(jī)分成Blank、TNF-α、DEX+TNF-α、UVB+DEX+TNF-α、Rg1+UVB+DEX+TNF-α及UVB+TNF-α組，通過檢測小鼠UVB照射部位表皮厚度、氧自由基、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、IL-6及IL-8的水平，觀察Rg1在體內(nèi)是否可以在氧化應(yīng)激狀態(tài)下增強(qiáng)DEX抗炎作用。
　　結(jié)果:

12、
　　1.人參皂苷單體Rb1、Rh1、Rg1及Rb3均能顯著抑制氧自由基的形成，并輔助DEX抑制炎癥因子IL-6及IL-8的分泌，其中Rg1作用最為明顯。
　　2.通常狀態(tài)下，DEX能夠顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-6及IL-8的分泌，但是在UVB或者H2O2處理后，DEX上述能力下降;同時(shí)我們進(jìn)一步探討其炎癥通路發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，DEX抑制MAPKs通路中P38、ERK及JNK磷酸化的能力減弱，同時(shí)對NF-KB通路Iκ

13、Bα的磷酸化及P65的核轉(zhuǎn)位的抑制作用也顯著下降，但Rg1能夠顯著增DEX上述作用。
　　3.氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Rg1能夠改善GCs抵抗，其作用可能通過Rg1增強(qiáng)Nrf2核轉(zhuǎn)位，抑制ROS，上調(diào)HDAC2的表達(dá)，抑制GR的乙酰化，提高GR表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)DEX的抗炎作用。
　　4.Balb/c小鼠UVB照射性皮炎模型證實(shí)，Rg1能夠有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)DEX的抗炎作用。
　　結(jié)論:
　　Rg1通過激活Nrf2，