流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素受體評(píng)價(jià)激素反應(yīng)性及人參總皂苷作用的研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、代謝、免疫及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過(guò)程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用。臨床上,GC又是應(yīng)用最為廣泛的甾體激素類(lèi)藥物,自20世紀(jì)50年代起就作為抗炎和免疫抑制劑,用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、慢性哮喘等疾病的治療。因此,GC是一種極具生理及藥理作用的甾體激素。 GC的效應(yīng)是由糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。生物體組織細(xì)

2、胞對(duì)GC的反應(yīng)性主要取決于兩個(gè)方面：內(nèi)外環(huán)境中GC的水平以及個(gè)體自身對(duì)GC的敏感性,也就是GR介導(dǎo)GC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。由于糖皮質(zhì)激素在生命過(guò)程中所發(fā)揮的作用極其重要,完全的糖皮質(zhì)激素抵抗是罕見(jiàn)的。然而,不同個(gè)體對(duì)糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)存在較大差異,這種差異部分是由于GR數(shù)量和結(jié)合力下降引起的。過(guò)去已有研究發(fā)現(xiàn)哮喘病人在治療期間GR數(shù)量減少與激素療效下降之間具有一定的相關(guān)性。如能在治療前通過(guò)檢測(cè)GR預(yù)測(cè)激素反應(yīng)性,調(diào)節(jié)激素用量,對(duì)可能發(fā)生激

3、素抵抗的病人早期采取聯(lián)合應(yīng)用免疫制劑等措施,則有可能避免盲目大劑量使用激素帶來(lái)的副反應(yīng),使患者獲得較多的收益。另外,對(duì)于那些不得不長(zhǎng)期大劑量激素治療的患者,即使是激素敏感,在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療后也不可避免地會(huì)出現(xiàn)激素反應(yīng)性下降。GR下調(diào)是重要內(nèi)因,然而目前尚缺乏有效的干預(yù)手段。 本課題組在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人參總皂苷能改善大劑量糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的GR下調(diào)。但人參總皂苷能否在臨床中上調(diào)GR,并由此提高激素反應(yīng)性,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因

4、此,選擇一種可靠、簡(jiǎn)便的臨床GR檢測(cè)方法,對(duì)于在治療前了解個(gè)體激素反應(yīng)性,制定合理治療方案,及評(píng)價(jià)GR調(diào)節(jié)劑療效都具有重要的臨床意義。 目前比較常用的檢測(cè)GR的方法,比如3H標(biāo)記的放射性配基結(jié)合分析、Western-blot,操作繁瑣,且無(wú)法在多種組織細(xì)胞混合存在的情況下反映某一特定細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞中的GR,另外,3H標(biāo)記的放射性配基由于需要使用放射性物質(zhì),使用受到很大限制。而流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于不僅操作簡(jiǎn)便,可以根據(jù)細(xì)胞大小和

5、胞漿內(nèi)顆粒密度,或者細(xì)胞表面分子標(biāo)記來(lái)區(qū)分單個(gè)細(xì)胞,而且還以可通過(guò)熒光標(biāo)記的配體和單克隆抗體同時(shí)檢測(cè)GR結(jié)合力和蛋白表達(dá)。 本課題的研究目的： 1、通過(guò)與傳統(tǒng)檢測(cè)GR方法比較,評(píng)價(jià)FITC-Dex和GR單克隆抗體兩種探針標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)GR結(jié)合力和蛋白表達(dá)的可靠性； 2、采用流式細(xì)胞術(shù)觀察激素抵抗和激素敏感的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合征病人GR的改變,初步探討其預(yù)測(cè)激素療效的可能性； 3、在本研究小

6、組體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參總皂苷上調(diào)GR基礎(chǔ)上,采用該方法觀察人參總皂苷在臨床上對(duì)長(zhǎng)期大劑量使用激素的系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人GR的影響。 本課題的研究意義在于：1.初步探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GR預(yù)測(cè)激素反應(yīng)性的可能性；2.初步證實(shí)人參總皂苷在臨床上可以通過(guò)上調(diào)GR增強(qiáng)激素效應(yīng)。 本課題采用的方法： 1、給予U937和K562細(xì)胞株濃度為10-5M地塞米松處理48h,建立體外GR下調(diào)模型,分別采用放射性配基、Western-

7、blot和FITC-Dex和GR-mAb標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GR,評(píng)價(jià)該方法的可靠性；并采用激光共聚焦觀察免疫熒光標(biāo)記的兩種探針對(duì)胞內(nèi)GR染色后,GR在U937和K562細(xì)胞中的定位,及其對(duì)Dex干預(yù)的反應(yīng)； 2、選擇35名系統(tǒng)性紅斑狼瘡及23名腎病綜合征患者,采用FCM檢測(cè)激素治療前同一時(shí)間點(diǎn)外周血T淋巴細(xì)胞(CD3+)和單核細(xì)胞(CD14+)亞群GR;系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人根據(jù)治療后的SLEDAI評(píng)分改變,腎病綜合征病人根據(jù)尿蛋

8、白變化,再分為激素抵抗和激素敏感組,觀察GR在兩組中的變化； 3、采用雙盲隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì),收集32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人,分為人參總皂苷干預(yù)組和安慰劑組,給予相應(yīng)藥物治療3個(gè)月后,觀察可以反映病情的SLEDAI評(píng)分、ESR、C3、抗ds-DNA的變化,并采用FCM檢測(cè)治療前后GR,評(píng)價(jià)人參總皂苷對(duì)GR的影響及其與療效間的相關(guān)性。 結(jié)果表明： 1、U937和K562細(xì)胞株經(jīng)Dex處理后,GR蛋白和結(jié)合力較空白組顯著下降

9、,FCM檢測(cè)到的結(jié)果分別與Western-blot和3H標(biāo)記的放射性同位素檢測(cè)結(jié)果成正相關(guān)。激光共聚焦觀察在沒(méi)有經(jīng)過(guò)Dex處理的對(duì)照組,anti-GR mAb染色后的GR主要存在于U937和K562細(xì)胞的胞漿中,核/漿比小于1,經(jīng)過(guò)Dex處理48h后,兩種細(xì)胞株FITC平均熒光強(qiáng)度下降(p<0.01);在無(wú)Dex處理組,經(jīng)FITC-Dex染色后的GR主要存在于胞核內(nèi),核/漿比大于1,MFI在U937和K562細(xì)胞中的核/漿比分別是1.1

10、4±0.06和1.28±0.13,經(jīng)過(guò)Dex處理24h后,FITC平均熒光強(qiáng)度和核/漿比均顯著下調(diào)(p<0.01),核/漿比分別是0.94±0.05 and 0.82±0.06。 2、檢測(cè)部分SLE和NS病人治療前外周血GR,結(jié)果系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合征病人中的激素敏感組外周血CD3/GR和CD14/GR的結(jié)合力和蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異(all p>0.05)；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人中,激素抵抗組CD3/GR和CD

11、14/GR的結(jié)合力和蛋白表達(dá)與激素敏感組比較均顯著降低(all p<0.01)。在腎病綜合征病人中也得到了相似的結(jié)果,激素抵抗組CD3/GR和CD14/GR結(jié)合力較激素敏感組顯著降低(p<0.01),但是兩組間蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(p>0.05)； 3、評(píng)價(jià)人參總皂苷臨床療效,治療后三個(gè)月人參總皂苷組CD3+和CD14+細(xì)胞群GR蛋白表達(dá)變化與安慰劑組比較無(wú)顯著差異(p>0.05),但CD3+細(xì)胞群GR結(jié)合力較安慰劑組顯著增加(p

12、<0.01),CD14+細(xì)胞群GR結(jié)合力也較安慰劑組具有改善趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.28);治療后人參總皂苷組SLEDAI評(píng)分明顯下降,安慰劑組則升高,人參總皂苷組SLEDAI評(píng)分較安慰劑組明顯改善(p<0.01)：另外,人參總皂苷組ESR、抗ds-DNA、C3也均較安慰劑組有所改善,但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(allp>0.05)。 根據(jù)以上結(jié)果可以初步得出以下結(jié)論： 1、兩種探針標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GR結(jié)合力和蛋