阻斷Notch通路在骨肉瘤小鼠模型生物學(xué)發(fā)生及發(fā)展中的作用機制研究.pdf

1、背景：
　　骨肉瘤（osteosarcoma）是惡性程度較高的間葉組織來源骨腫瘤，多發(fā)生于青少年，惡性程度較高，目前主流的治療手段包括新輔助化療聯(lián)合外科手術(shù)治療，但是由于腫瘤復(fù)發(fā)、早期的肺轉(zhuǎn)移以及放化療的毒副作用使得其五年生存率沒有明顯的提高，因此需要新的治療手段來彌補傳統(tǒng)治療方法的不足?？鼓[瘤血管生成治療是極具潛力的靶向治療手段，通過抑制腫瘤血管的生存達到抑制腫瘤生長、浸潤基遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的，由于其作用準(zhǔn)確，不影響正常組織的血管生

2、長，因此是目前研究的新熱點。
　　Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一項最新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤血管發(fā)生有關(guān)的信號通路，其在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中起著雙重作用，目前已有多項研究證實阻斷Notch通路可以明顯抑制皮膚癌、肝癌、胃腸道腫瘤以及宮頸癌、乳腺癌的發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移，但在骨肉瘤的血管生成方面研究較少，因此我們的研究關(guān)注于Notch信號通路與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系以及其發(fā)揮作用的靶向通路，從而為利用Notch通路達到治療骨肉瘤的目的提高理論依據(jù)及

3、可行性，進而改善目前的骨肉瘤治療手段。
　　目的：
　　研究Notch-1通道阻斷劑GSI在抑制小鼠骨肉瘤模型中腫瘤增長、細(xì)胞因子分泌等方面的影響，以及其抑制腫瘤血管生成作用，進而探討Notchl信號通路在小鼠骨肉瘤模型中的作用及其作用機制。為將來利用GSI對小鼠乃至人骨肉瘤的治療作用奠定實驗和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、實驗流程
　　1.1MG-63細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
　　MG-63骨肉瘤細(xì)胞在3

4、7℃、5％CO2飽和度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%的滅活胎牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100ug/ml的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，每48h換液。
　　1.2人骨肉瘤荷瘤SCID小鼠模型的建立
　?。?）飼養(yǎng)重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠40只，通過皮下注射人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞建立不同異體移植動物模型。左后肢皮下注射2×107個MG-63細(xì)胞，右后肢同部位注射PBS溶液作陰性對照。
　　（2）觀察觀

5、察荷瘤后小鼠的生長狀態(tài)及生物學(xué)特性的不同。每日監(jiān)測小鼠的體重、皮毛、活動情況、有無麻痹癱瘓癥狀和感染跡象等。經(jīng)皮下注射的小鼠還需測量皮下瘤塊的體積(ab2π/6，a為長徑，b為短徑)。
　　1.3研究阻斷Notch通路對骨肉瘤血管生成、腫瘤增長及侵襲的作用。
　　1.3.1應(yīng)用Notch通路阻斷劑GSI瘤內(nèi)注射，觀測阻斷Notch通路對腫瘤增長的影響。
　　將荷瘤成功后小鼠隨機分為三組，實驗組腫瘤內(nèi)注射Notch通路阻

6、斷藥物GSI（γ-分泌酶抑制劑，以DMSO作溶劑），每日1次，連續(xù)5天，對照組分別注射DMSO及PBS，每日監(jiān)測小鼠的體重、皮毛、活動情況、有無麻痹癱瘓癥狀和感染跡象等。經(jīng)皮下注射的小鼠還需測量皮下瘤塊的體積(ab2π/6，a為長徑，b為短徑)。
　　1.3.2腫瘤組織及轉(zhuǎn)移組織免疫組織化學(xué)方法檢測Notch-1、MMP-2及MMP-9表達及定位，同時檢測微血管密度（MVD）的表達情況與差異。
　　分離、摘除小鼠皮下瘤塊，用

7、10%甲醛固定、石蠟包埋并進行蘇木精-伊紅染色；免疫組織化學(xué)方法檢測Notch-1、MMP-2及MMP-9蛋白表達。病理標(biāo)本進行微血管密度(MVD)的檢測：使用兔抗小鼠CD31抗體標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，然后計數(shù)微血管。首先在100倍顯微鏡下選取血管密度較高的區(qū)域(“熱點”)，然后在400倍顯微鏡下進行拍照，并用圖像分析軟件分析計數(shù)微血管數(shù)。
　　1.3.3探討阻斷Notch通路對骨肉瘤血管生成、腫瘤增長及侵襲的作用及其分子機制。
　

8、　2、統(tǒng)計學(xué)分析
　　采用SPSS軟件，行配對t檢驗、單樣本t檢驗、秩和檢驗，統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1、MG-63細(xì)胞的生長形態(tài)
　　MG-63細(xì)胞在倒置顯微鏡下為長梭形，貼壁生長，傳代時間約為2d。
　　2、SCID裸鼠腫瘤模型成瘤性
　　成功建立MG-63骨肉瘤細(xì)胞系SCID小鼠骨肉瘤生長模型，40只SCID小鼠中進行左后肢皮下接種 MG-63細(xì)胞，荷瘤成功標(biāo)準(zhǔn)為皮下腫瘤結(jié)節(jié)長徑大于0.5c

9、m，36只小鼠在荷瘤實驗2周后出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)逐漸增大，到40天時均達到荷瘤成功標(biāo)準(zhǔn)（皮下腫瘤平均長徑為：6.348mm，平均短徑為：5.576mm，平均體積為：103.34mm3），荷瘤成功率90%。
　　3、荷瘤成功后SCID小鼠生物學(xué)變化
　　所有小鼠在荷瘤實驗后進行生物學(xué)指標(biāo)觀察，包括小鼠的體重、飲食、睡眠、運動情況、精神狀態(tài)、對刺激的反應(yīng)及小鼠的皮毛光澤度等等，接種后3周時見荷瘤小鼠步態(tài)遲緩，目光呆滯，體型消

10、瘦，反應(yīng)遲鈍，但未見死亡及明顯感染癥狀。同荷瘤失敗小鼠相比較，荷瘤成功小鼠的體重隨腫瘤體積增大及天數(shù)延長逐漸減輕，同時性情變得狂躁，常常出現(xiàn)互相撕咬情況，小鼠的飲食量較少，睡眠時間明顯縮短，對刺激的反應(yīng)性也有不同程度的下降。
　　4、GSI治療效果評價
　　4.1小鼠生物學(xué)指標(biāo)觀測
　　同對照組相比，GSI治療組小鼠的生物學(xué)指標(biāo)明顯較好，其小鼠的體重、飲食、睡眠、運動情況、精神狀態(tài)、對刺激的反應(yīng)及小鼠的皮毛光澤度等優(yōu)于

11、對照組，其皮下腫瘤體積增長緩慢，實驗組平均體積為（149.29mm3）較DMSO對照組平均體積（572.88mm3）及PBS對照組平均體積（492.06mm3）明顯縮小，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
　　4.2腫瘤的病理學(xué)評價
　　將小鼠瘤體切片后進行免疫組化染色，實驗組及對照組內(nèi)瘤體切片內(nèi)均見Notch-1、MMP-2及MMP-9表達，其中Notch-1表達于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色染色，MMP-2及MMP-9表達

12、于胞漿內(nèi)或胞膜出現(xiàn)黃染顆粒,呈棕黃色，與對照組相比實驗組Notch-1、MMP-2及MMP-9表達均明顯降低。實驗組及PBS、DMSO對照組Notchl平均秩次分別為5.56、31.2和29.3，實驗組及PBS、DMSO對照組MMP-2平均秩次分別為4.55、22.1和24.5，實驗組及PBS、DMSO對照組MMP-9平均秩次分別為3.59、26.3和27.8。
　　實驗組及對照組內(nèi)瘤體切片內(nèi)血管均見不同程度的CD31表達，其表達

13、于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，與對照組相比實驗組CD31表達均明顯降低，實驗組及PBS、DMSO對照組CD31平均秩次分別為4.03、28.8和32.5。
　　結(jié)論：
　　1、通過SCID小鼠骨肉瘤動物模型證實GSI可下調(diào)Notch信號通路中Notchl的表達和MMP-2、MMP-9等分子表達。
　　2、GSI對SCID小鼠骨肉瘤動物模型的治療作用通過抑制Notch通路進而干預(yù)腫瘤血管形成來實現(xiàn)的。
　　3、應(yīng)用GSI阻斷N