雷帕霉素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞及干細(xì)胞中雷帕霉素靶蛋白傳導(dǎo)通路的生物學(xué)作用及意義.pdf

1、目的:研究雷帕霉素對(duì)人骨肉瘤 MG-63細(xì)胞和骨肉瘤干樣細(xì)胞中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）傳導(dǎo)通路的影響，探討雷帕霉素在骨肉瘤聯(lián)合化療中的可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞和骨肉瘤干樣細(xì)胞，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞球中 Nanog和 Oct4的表達(dá)。以0、20、50和100 nmol/l濃度的雷帕霉素處理骨肉瘤細(xì)胞及骨肉瘤干樣細(xì)胞觀察檢測(cè)對(duì)其的生物學(xué)特性影響：采用半定量PCR和定量PCR法檢測(cè)不同濃度雷帕霉素處

2、理后骨肉瘤干樣細(xì)胞和未經(jīng)處理的骨肉瘤細(xì)胞中mTOR的表達(dá)。細(xì)胞存活能力，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性CCK-8還原為橙黃色甲臜溶解在培養(yǎng)液中，細(xì)胞死亡無(wú)法還原CCK-8。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定橙黃色甲臜吸光度值，可反映活細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞遷移能力，劃痕法測(cè)定遷移活性，遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)，腫瘤遷移需要一定運(yùn)動(dòng)能力。高轉(zhuǎn)移腫瘤通常具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。細(xì)胞侵蝕能力，細(xì)胞侵襲小室法測(cè)定其侵蝕

3、能力，惡性腫瘤細(xì)胞有局部侵襲作用及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移作用，惡性腫瘤首先在原發(fā)灶侵襲周圍組織然后進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)或進(jìn)入淋巴循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。惡性細(xì)胞要依賴腫瘤血管形成作用，即腫瘤血管形成作用導(dǎo)致或增強(qiáng)惡性腫瘤生長(zhǎng)以及侵襲。細(xì)胞成球能力，顯微鏡觀察、攝片、計(jì)數(shù)、觀察經(jīng)不同方法處理的骨肉瘤干細(xì)胞再形成骨肉瘤細(xì)胞球的能力，從體外水平闡明mTOR信號(hào)通路對(duì)維持骨肉瘤干細(xì)胞狀態(tài)的重要性。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡下可見(jiàn)，骨肉瘤MG-63細(xì)胞球較致密的核

4、心部分Nanog和Oct4呈陽(yáng)性表達(dá)，提示成球的骨肉瘤細(xì)胞球有干細(xì)胞特性。半定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，未經(jīng)雷帕霉素處理的骨肉瘤干樣細(xì)胞中mTOR mRNA的相對(duì)表達(dá)量，明顯高于人骨肉瘤 MG-63細(xì)胞。定量 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，100 nmol/l雷帕霉素處理組骨肉瘤干樣細(xì)胞中 mTOR mRNA的表達(dá)量，明顯低于0 nmol/l雷帕霉素處理組。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 nmol/l雷帕霉素處理組比較，20、50、70和100 nm

5、ol/l雷帕霉素處理組人骨肉瘤 MG-63細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制；20、50和70 nmol/l雷帕霉素對(duì)骨肉瘤干樣細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的抑制作用，但100 nmol/l雷帕霉素對(duì)骨肉瘤干樣細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，雷帕霉素可以有效抑制骨肉瘤干樣細(xì)胞的成球特性。雷帕霉素處理骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞遷移能力明顯受限，未經(jīng)雷帕霉素處理的骨肉瘤干樣細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)于骨肉瘤細(xì)胞，70和100 nmol/l雷帕霉素處理組骨肉瘤干樣細(xì)胞可