miR-195在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的最常見(jiàn)的骨的惡性腫瘤，約40％左右的病例出現(xiàn)的遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移（主要為肺轉(zhuǎn)移），是導(dǎo)致治療失敗和死亡的最主要原因，因此尋找新的有效的骨肉瘤的早期診斷工具及治療方法極為迫切。
　　miRNA是一類(lèi)在真核生物中發(fā)現(xiàn)的非編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，其大小約為22-25nt，可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因mRNA，使其直接降解或翻譯抑制，從而達(dá)到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。研究表明，miRNA參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控，可能起

2、到轉(zhuǎn)移激活物或抑制物的作用。同時(shí)由于其表達(dá)具有高度組織特異性、保守性和時(shí)序性，miRNA被視為一種新的相對(duì)特異的腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物。miRNA可作為特異性腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物的特性，同樣為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了新的希望，但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性miRNA的研究卻非常有限。
　　本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期開(kāi)展骨腫瘤的基礎(chǔ)研究，在自行建立的兩株來(lái)自同一母系但具有不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細(xì)胞系F4和F5M2的基礎(chǔ)上，利用miRNA芯片對(duì)其

3、進(jìn)行表達(dá)譜的分析，初步篩選出8個(gè)差異表達(dá)的miRNA。這些差異表達(dá)的miRNA能否成為特異性的骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性標(biāo)志物，還有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)前期研究基礎(chǔ)上，以在高轉(zhuǎn)移潛能骨肉瘤細(xì)胞系F5M2中呈低表達(dá)狀態(tài)的has-miR-195為研究對(duì)象，研究其在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能和作用機(jī)制，明確其可能作用的靶基因，并探索miR-195及其靶基因作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的可能性。
　　研

4、究方法：
　　1.采用TaqMan?探針實(shí)時(shí)定量PCR分析的方法，對(duì)利用miRNA芯片篩選出來(lái)的在不同轉(zhuǎn)移潛能的骨肉瘤細(xì)胞系F4和F5M2中差異表達(dá)的miR-195進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.構(gòu)建表達(dá)miR-195的pSilencer4.1-CMV載體，用其轉(zhuǎn)染F5M2細(xì)胞，并用G418篩選出穩(wěn)定上調(diào)miR-195表達(dá)水平的骨肉瘤細(xì)胞系及其對(duì)照組細(xì)胞系。
　　3.利用構(gòu)建的上調(diào)miR-195表達(dá)水平的骨肉瘤細(xì)胞系F5M2+mi

5、R-195，進(jìn)行miR-195的功能獲得型研究。在體外水平，觀察F5M2+miR-195細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力；在裸鼠體內(nèi)，觀察F5M2+miR-195細(xì)胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力。
　　4.利用三個(gè)不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-195進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)分析，并對(duì)照不同轉(zhuǎn)移潛能骨肉瘤細(xì)胞系F4和F5M2之間差異表達(dá)的47個(gè)基因，篩選出miR-195的潛在靶基因，然后分別從基因水平和蛋白水平對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。
　　5.收

6、集不同轉(zhuǎn)移能力的臨床骨肉瘤樣本33例，分別利用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)miR-195和FZD10的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)趨勢(shì)與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.Real-timeRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-195在F4和F5M2中差異表達(dá)，并且在F5M2中的表達(dá)較F4明顯降低。
　　2.成功構(gòu)建了miR-195的表達(dá)載體pSilencer-miR-195，并篩選出穩(wěn)定上調(diào)miR-195

7、表達(dá)水平的骨肉瘤細(xì)胞系F5M2+miR-195及其對(duì)照組細(xì)胞系F5M2+NC，Real-timeRT-PCR檢測(cè)顯示miR-195在F5M2+miR-195細(xì)胞中的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高。
　　3.在體外水平，F(xiàn)5M2+miR-195細(xì)胞與F5M2+NC細(xì)胞相比，其增殖能力無(wú)明顯變化，細(xì)胞凋亡略有增加，細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低；在裸鼠體內(nèi)，F(xiàn)5M2+miR-195細(xì)胞的原位成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力均明顯降低。
　　4.生物信息

8、學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合靶基因功能分析，篩選出miR-195的一個(gè)潛在靶基因FZD10。免疫細(xì)胞化學(xué)染色及westblotting結(jié)果顯示miR-195可以降低骨肉瘤細(xì)胞F5M2中FZD10的蛋白表達(dá)量，熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示miR-195可以和FZD10的3’UTR的直接結(jié)合。
　　5.相比隨訪存活且未發(fā)生轉(zhuǎn)移組臨床骨肉瘤樣本，隨訪死亡或發(fā)生轉(zhuǎn)移組中miR-195的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而FZD10的蛋白表達(dá)量明顯增高。
　　研究結(jié)

9、論：
　　1.miR-195的表達(dá)趨勢(shì)與骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)性，這就提示有必要對(duì)miR-195在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的功能及作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。
　　2.成功構(gòu)建了穩(wěn)定上調(diào)miR-195表達(dá)水平的骨肉瘤細(xì)胞系F5M2+miR-195及其對(duì)照組細(xì)胞系F5M2+NC，為進(jìn)行miRNA在骨肉瘤細(xì)胞中的功能獲得型研究提供了前提條件。
　　3.在體外水平，miR-195可以明顯地抑制骨肉瘤細(xì)胞F5M2的遷移和侵襲能力，同時(shí)具