二甲雙胍對上皮性卵巢癌化療耐藥的抑制作用研究.pdf

1、目的:
　　二甲雙胍常用于治療2型糖尿病，近年來發(fā)現二甲雙胍有抑制惡性腫瘤生長的作用并且增強化療藥物的療效。在婦科惡性腫瘤中，致死率最高的為卵巢癌，對于此疾病的預后而言，關鍵點在于摸索出預防以及逆轉耐藥的有效對策。有研究表明惡性腫瘤的形成和發(fā)展與IGF-1R密不可分，胰島素樣生長因子系統(tǒng)（IGF-I、IGF-1R和AKT）與卵巢癌耐藥有關。因此我們實驗目的通過研究二甲雙胍對耐藥卵巢癌細胞中IGF系統(tǒng)的作用來探討二甲雙胍對上皮性卵巢

2、癌化療的耐藥機制，找尋一種新的卵巢癌的輔助治療方法。
　　方法:
　　(1)采用原位雜交技術、免疫組化和免疫熒光技術檢測上皮性卵巢癌組織、良性腫瘤組織，正常卵巢組織中MRP2蛋白和mRNA表達，分析其與卵巢癌生物學特征之間的關系;
　　(2)CCK-8法檢測細胞增殖能力并繪制生長曲線，計算耐藥卵巢癌細胞鉑類的耐藥指數;
　　(3)流式細胞儀、AnnexinV/PI雙染法檢測CP70細胞周期及凋亡;
　　(4

3、)蛋白質印跡法檢測不同濃度二甲雙胍作用CP70細胞后MRP2及相關信號通路IGF信號通路中IGF-1，IGF-1R，AKT蛋白的表達水平變化;
　　(5)熒光定量PCR法檢測不同濃度二甲雙胍作用CP70細胞后，MRP2及IGF-1，IGF-1R，AKT，p-IGF1，p-IGF1R，p-AKT基因表達的變化;
　　(6)建立順鉑耐藥人卵巢癌CP70細胞株和不耐藥A2780細胞株皮下移植瘤模型分析二甲雙胍對裸鼠移植瘤組織中MR

4、P2表達的影響及其對腫瘤的抑制。
　　結果:
　　(1)MRP2蛋白表達在正常卵巢組織、良性卵巢組織和上皮性卵巢癌中的陽性表達率分別為0(0/5)，20％(2/10)和58％(14/25)，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;MRP2基因表達在正常卵巢組織、良性卵巢組織以及上皮性卵巢癌中的陽性表達率分別為0(0/5)，10％(1/10)和48％(12/25)，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。卵巢上皮癌組織中MRP2蛋白以及MRP

5、2mRNA的表達不受病人年齡、病理分期影響，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），但其表達與病理類型、有無淋巴結轉移有關(P＜0.05)。
　　(2)用不同濃度的二甲雙胍作用于卵巢癌細胞株A2780和耐藥細胞株CP70后，對順鉑的敏感性增加。CCK-8法檢測二甲雙胍處理CP70細胞24h后，對順鉑的耐藥倍數明顯下降，且呈濃度依賴性。
　　(3)CP70細胞周期分布隨著二甲雙胍濃度升高而發(fā)生明顯改變，表現為G0/G1期比例增多，1

6、0mM/ml與0.01mM/ml組相比差異有顯著性(F=69.514，P＜0.05)，100mmol/L二甲雙胍濃度的自然凋亡率與10mmol/L濃度比較差異有統(tǒng)計學意義（F=79.814，P＜0.05）。
　　(4)蛋白質印跡法檢測二甲雙胍處理CP70細胞48h后，發(fā)現IGF-1，IGF-1R，AKT的表達都隨著二甲雙胍濃度的增加呈現逐漸降低的趨勢，p-IGF1，P-IGF1R，P-AKT降低趨勢相比較于IGF-1，IGF-1R

7、，AKT更明顯，二者都有明顯的濃度依賴性。各蛋白組與β-actin相對灰度比與0mM/ml濃度二甲雙胍比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中0mM/ml二甲雙胍+阻斷劑LY294002組10mM/ml聯(lián)合應用對卵巢癌細胞CP70細胞的抑制作用最顯著。
　　(5)二甲雙胍可以影響MRP2及IGF-1，IGF-1R，AKT，p-IGF1，p-IGF1R，p-AKT基因的表達，并呈濃度依賴性，從而抑制CP70細胞的增殖活性，不同濃

8、度的二甲雙胍組與正常對照組表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(6)觀察A2780組和CP70組裸鼠的腫瘤體積與生長情況發(fā)現，順鉑組+二甲雙胍組的腫瘤體積明顯小于對照組和單純使用順鉑治療組，A2780+順鉑+二甲雙胍的抑瘤率為59.16％，CP70+順鉑+二甲雙胍的抑瘤率則為79.03％，均明顯高于單純使用順鉑，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(7)體內實驗證明二甲雙胍抑制MRP2蛋白的表達，且順鉑+二甲雙胍

9、兩種藥物聯(lián)合使用較單獨使用對A2780、CP70細胞具有更高的抑制率，兩藥表現出協(xié)同作用。
　　結論:
　　(1)MRP2蛋白在上皮性卵巢癌中有陽性表達，表達水平與卵巢癌類型和淋巴結轉移有關。
　　(2)一定濃度的二甲雙胍可以增強順鉑對卵巢癌CP70細胞的敏感性。
　　(3)二甲雙胍通過抑制IGF信號通路IGF-1、IGF-1R和AKT受體的表達抑制MRP2蛋白抑制卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。
　　(4)體內