豬圓環(huán)病毒2型編碼蛋白4的鑒定及其感染后的宿主免疫器官基因表達(dá)譜分析.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。目前的研究已經(jīng)鑒定了該病毒的三個(gè)編碼蛋白，即ORF1編碼的與復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF2編碼的衣殼蛋白Cap，以及ORF3編碼的凋亡相關(guān)蛋白ORF3蛋白。本研究鑒定了豬圓環(huán)病毒2型ORF4編碼蛋白，并分析了豬圓環(huán)病毒2感染后宿主免

2、疫器官的基因表達(dá)譜，旨在探討PCV2編碼蛋白在致病中的作用及其宿主的反應(yīng)性。
　　 1.PCV2ORF4蛋白轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的驗(yàn)證
　　 本研究利用表位預(yù)測(cè)軟件BepiPred1.0 Server分析出的PCV2潛在的ORF4抗原表位，借助化學(xué)合成法合成了含PCV2-ORF4的表位多肽，以合成的表位多肽和真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-ORF4為抗原免疫BALB/c小鼠制備了抗PCV2-ORF4編碼蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體。利用制

3、備的ORF4單克隆抗體和和多克隆抗體可在PCV2感染及ORF4基因轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞中檢測(cè)到特異性的信號(hào)，但不能在正常PK15細(xì)胞和ORF1、2、3基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢測(cè)到任何信號(hào)，說(shuō)明在PCV2感染細(xì)胞中獨(dú)立于ORF1、ORF2和ORF3外存在基因編碼的新的病毒蛋白ORF4。Northern blot的結(jié)果顯示，ORF4相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本約為180bp，利用了與ORF3不同的起始密碼子，其轉(zhuǎn)錄本完全疊加在ORF3內(nèi)，轉(zhuǎn)錄方向與ORF3相同。上述

4、結(jié)果分別從蛋白和轉(zhuǎn)錄本水平驗(yàn)證了PCV2ORF4基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，為后續(xù)該蛋白的功能研究提供了依據(jù)。
　　 2.ORF4蛋白體內(nèi)外功能研究
　　 為了分析PCV2-ORF4編碼蛋白的功能，本研究構(gòu)建了缺失ORF4蛋白的感染性克隆(PCV2△)，并以PK15細(xì)胞為載體拯救出缺失體病毒PCV2△，經(jīng)復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析提示ORF4蛋白是PCV2復(fù)制的非必需蛋白。利用拯救的PCV2△和野生型病毒(wPCV2)分別感染細(xì)胞和小鼠分析O

5、RF4蛋白的功能。結(jié)果顯示，PCV2△感染細(xì)胞后能夠引起caspase-3、8、9活性的提高，提示ORF4與凋亡抑制相關(guān)。在PCV2△感染小鼠體內(nèi)，與野生型病毒比較，PCV2△感染鼠的血清病毒載量提高約20～100倍，并展示早期較為嚴(yán)重的淋巴組織損傷。與此同時(shí)在PCV2△體內(nèi)出現(xiàn)了嚴(yán)重的CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞減少，說(shuō)明ORF4蛋白缺失的PCV2在小鼠體內(nèi)比野生型PCV2具有更強(qiáng)的致病力，揭示ORF

6、4基因是PCV2致病的負(fù)調(diào)控基因。
　　 3.豬圓環(huán)病毒2感染后的宿主免疫組織基因表達(dá)譜分析
　　 為了分析PCV2感染后免疫器官的反應(yīng)性，我們使用基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平分析了PCV2感染豬淋巴結(jié)和小鼠脾臟的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示，在PCV2感染豬的腹股溝淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)66個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本，主要包括:44個(gè)涉及大分子代謝(20％)、分化及發(fā)育(18％)、轉(zhuǎn)運(yùn)(13％)及細(xì)胞骨架(7％)相關(guān)上調(diào)轉(zhuǎn)錄本，22個(gè)涉及免疫及炎癥反應(yīng)

7、(57％)、代謝(9％)的下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。在PCV2感染的小鼠脾臟發(fā)現(xiàn)137個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本，包括:40個(gè)影響代謝(12％)、分化及發(fā)育(12％)、免疫(10％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(10％)、大分子生物合成相關(guān)(10％)的上調(diào)轉(zhuǎn)錄本，73個(gè)影響代謝(13％)、分化及發(fā)育(15％)、免疫反應(yīng)(12％)、大分子生物合成(11％)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)(11％)的下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)基因芯片所獲得的20個(gè)豬差異轉(zhuǎn)錄本和29個(gè)小鼠差異轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行了驗(yàn)