豬圓環(huán)病毒Ⅱ?qū)ωi的實(shí)驗(yàn)性感染及其Cap蛋白誘導(dǎo)的小鼠免疫應(yīng)答類(lèi)型.pdf

1、本文從如下四個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　 1.PCV2熒光PCR方法的建立與豬的實(shí)驗(yàn)性感染
　　 通過(guò)設(shè)計(jì)合成特異性熒光PCR引物、反應(yīng)條件優(yōu)化和特異性試驗(yàn),建立了檢測(cè)PCV2 Cap基因特異片段的熒光定量PCR方法(qPCR),確定PCV2檢測(cè)極限的核酸拷貝臨界值為5×103/ml。借助建立的qPCR檢測(cè)豬臨床血清樣本中的PCV2 DNA水平,發(fā)現(xiàn)qPCR的陽(yáng)性與ELISA和IFA抗體的檢查結(jié)果沒(méi)有線性關(guān)系。為此,試驗(yàn)確定q

2、PCR檢測(cè)的拷貝數(shù)＜5×103/ml的豬血清樣本為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。隨后,用PCV2人工感染8周齡的實(shí)驗(yàn)豬,進(jìn)一步調(diào)查了PCV2感染豬病毒核酸動(dòng)態(tài)變化及PCV2感染的病變特征。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:在感染后1周,感染豬的血清出現(xiàn)PCV2核酸拷貝數(shù)的峰值,隨后持續(xù)下降,至感染后4周維持拷貝數(shù)極低的陽(yáng)性臨界值附近。但從感染后連續(xù)14周的血清PCV2 DNA的監(jiān)控情況看,人工感染豬存在PCV2的持續(xù)性感染。同時(shí),肺、脾、淋巴結(jié)和胃等組織具有較高的

3、PCV2核酸拷貝。眼觀與組織病理學(xué)結(jié)果顯示:豬在接種PCV2病毒后出現(xiàn)了輕度至中度的病變,包括淋巴結(jié)水腫出血、肺淤血出血等大體病變,以及淋巴組織中不同程度的淋巴細(xì)胞缺失、巨噬細(xì)胞及多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管性肺炎、腎和胰出血、肝細(xì)胞顆粒變性等顯微病變。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明,持續(xù)性感染是PCV2感染的重要特征,血清與組織中PCV2 DNA的拷貝數(shù)以及淋巴組織和肺等組織的顯微病變可以作為測(cè)定PCV2致病力的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.ORF2基因真核質(zhì)粒

4、與Cap蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類(lèi)型
　　 ORF2是PCV2主要的保護(hù)性免疫原基因,本研究通過(guò)構(gòu)建ORF2真核表達(dá)質(zhì)粒(pORF2)和重組表達(dá)Cap蛋白(Cap),應(yīng)用pORF2和Cap構(gòu)成不同的免疫接種組合,探索了pORF2和Cap在誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答方面的差異。結(jié)果顯示:ORF2質(zhì)粒在誘導(dǎo)抗原特異性CD8+脾細(xì)胞方面優(yōu)于Cap蛋白,而兩者在誘導(dǎo)Cap特異性增殖反應(yīng)及CD4+細(xì)胞方面能力相當(dāng)。ORF2質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了Th1型免疫

5、反應(yīng),Cap蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了Th2型免疫反應(yīng)。Cap在攻毒前誘導(dǎo)了較ORF2質(zhì)粒強(qiáng)的ELISA抗體反應(yīng),卻在攻毒后誘導(dǎo)了較ORF2質(zhì)粒弱的中和抗體記憶反應(yīng)。ORF2質(zhì)粒與Cap蛋白的協(xié)同使用可有效提高激活的CD8+細(xì)胞含量和發(fā)展平衡的Th1/Th2型免疫反應(yīng),特別是在用pORF2質(zhì)?；A(chǔ)免疫、Cap蛋白加強(qiáng)免疫的免疫程序中。在小鼠PCV2攻毒保護(hù)試驗(yàn)中,ORF2質(zhì)粒的免疫保護(hù)效力優(yōu)于Cap蛋白。這些結(jié)果表明,ORF2質(zhì)粒主要誘導(dǎo)了C

6、D8+T細(xì)胞和Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng),Cap蛋白主要誘導(dǎo)了Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng),CD8+T細(xì)胞和Th1型免疫應(yīng)答在抵抗PCV2感染中發(fā)揮了重要作用。
　　 3.ORF1,3和4編碼產(chǎn)物對(duì)ORF2編碼產(chǎn)物誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答能力的影響構(gòu)建了PCV2 ORF1(pORF1)、ORF3(pORF3)和ORF4(pORF4)真核表達(dá)載體,以及ORF1、3和4與ORF2的融合表達(dá)載體,將PCV2 ORF1、3和4與ORF2混合或融合使用,比較了

7、不同免疫策略對(duì)ORF2基因疫苗在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫、體液免疫以及保護(hù)效力的影響。在細(xì)胞免疫方面,ORF1與ORF2的融合或混合免疫、以及ORF3與ORF2的混合免疫,均誘導(dǎo)了與pORF2質(zhì)粒單獨(dú)使用相當(dāng)?shù)腃ap特異性增殖反應(yīng)和CD4+細(xì)胞,但CD8+細(xì)胞比率下降,顯示ORF1、3抑制了pORF2激活CD8+細(xì)胞的能力;而pORF4的混合使用對(duì)pORF2質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫沒(méi)有明顯影響。在體液免疫方面,pORF2-ORF1以及pORF

8、1、3、4和pORF2質(zhì)粒的混合免疫均成功誘導(dǎo)了相應(yīng)的抗ORF1、3、4蛋白抗體,尤其是高水平的抗ORF3和ORF4蛋白抗體,但ORF1及pORF3抑制了ORF2誘導(dǎo)的抗Cap蛋白的抗體反應(yīng)。亞型測(cè)定表明,誘導(dǎo)的針對(duì)Cap蛋白的免疫反應(yīng)為T(mén)h1型,而針對(duì)ORF1、ORF3與ORF4蛋白的免疫反應(yīng)的偏嗜性不明顯。在攻毒試驗(yàn)中,融合或混合使用組中只有pORF2+pORF3和pORF2+pORF4組提供了有效免疫保護(hù),但其保護(hù)效率不高于pOR

9、F2和PCI-neo空質(zhì)粒的混合免疫。這些資料說(shuō)明ORF1、3、4對(duì)ORF2的小鼠免疫沒(méi)有促進(jìn)作用。
　　 4.豬細(xì)胞因子對(duì)PCV2 ORF2基因編碼產(chǎn)物誘導(dǎo)的小鼠免疫應(yīng)答能力的影響
　　 構(gòu)建了豬IL2(pIL2)、IL4(pIL4)和IFN-γ(pIFN-γ)的真核表達(dá)載體,并構(gòu)建了ORF2與各豬細(xì)胞因子的融合表達(dá)載體,研究了豬IL2、IL4、及pIFN-γ作為基因佐劑對(duì)ORF2基因疫苗在小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫、體

10、液免疫以及保護(hù)效力的影響。pIL2、pIL4、pIFN-γ與ORF2的混合使用時(shí)誘導(dǎo)Cap特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和CD4+CD8-細(xì)胞的能力與pORF2相當(dāng),而在誘導(dǎo)CD4-CD8+和CD4+CD8+細(xì)胞方面,pORF2+pIL2組占有優(yōu)勢(shì)。盡管pIL4與pORF2的混合組誘導(dǎo)了高于pIL2和pIFN-γ的抗體水平,但與pORF2和空質(zhì)粒的混合使用相比,未起到明顯增強(qiáng)作用。抗體亞型測(cè)定表明,pIL2、pIL4和pIFN-γ與pORF2質(zhì)

11、粒的混合免疫均誘導(dǎo)了Th1型反應(yīng),但pIL2抑制了IgG1抗體的產(chǎn)生而使Th1型免疫反應(yīng)更強(qiáng)烈。從免疫保護(hù)效力看,pORF2+pIL2比pORF2+pIL4和pORF2+pIFN-γ提供了更有效的保護(hù),但三者的混合使用均未起到增強(qiáng)作用。意外的是,所構(gòu)建的ORF2與豬細(xì)胞因子的融合質(zhì)粒均未能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV2的免疫反應(yīng)及保護(hù)作用?？傊?本研究表明,pIL4和pIFN-γ的混合使用未起到佐劑作用,但pIL2可提高pORF2質(zhì)粒的細(xì)胞免