擬南芥EFR與黑腹果蠅SCOT蛋白重組表達(dá)、純化及晶體研究.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其霰人已繹發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得墓舜象匆蹲或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：紛癡眷目簽字日期：如侈年‘月7日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定

2、，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和傳閱。本人授磁時(shí)以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存j匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))學(xué)位論文作者簽名：絳岬導(dǎo)師簽名：妒出簽字日期：仂l多年6月7日簽字日期：叫多年6月歹7日學(xué)位論文作者畢業(yè)去向：工作單位：電話：通訊地址：郵編：的NBLRR蛋白識(shí)別外源病原微生物效應(yīng)因子激活并下游免疫應(yīng)答反應(yīng)的

3、途徑仍然不清晰。因此我們分別依次構(gòu)建了擬南芥EFR(6751031)His—TEVpET28a／EFR(681—1019)一His—TEVpET28a／EFR(695—1002)一His—TEVpET28a重組表達(dá)質(zhì)粒。試表達(dá)檢測(cè)表明除了EFR(6951002)一His—TEVpET28a蛋白不表達(dá)，其它兩個(gè)亞克隆都能表達(dá)蛋白。通過(guò)NiNTA親和層析柱進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)EFR(6751031)一His—TEVpET28a／EFR(681—1

4、019)His—TEVpET28a表達(dá)出的目的蛋白可溶。EFR(675—1031)一His—TEVpET28a和EFR(69l一1019)一His—TEVpET28a表達(dá)出的目的蛋白經(jīng)NiNTA親和層析和superdex200凝膠過(guò)濾層析后，得到高純度的穩(wěn)定均一蛋白用于蛋白晶體生長(zhǎng)。通過(guò)坐滴氣象擴(kuò)散法，采用HamptonResearchCrystalScreenI、CrystalScreenII、SaltRxTMl、SaltRxTM2、

5、PEGRxTMl、PEGRxTM2、EmeraldBiosystemsWizardI、WizardII、IndexI和IndexII蛋白晶體生長(zhǎng)試劑盒進(jìn)行蛋白晶體篩選。琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT)催化琥珀酰輔酶A和乙酰乙酸生成乙酰乙酰輔酶A和琥珀酸。乙酰乙酰輔酶A在線粒體中硫解酶的作用下產(chǎn)生成兩分子乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。琥珀酰一CoA轉(zhuǎn)移酶(SCOT)催化琥珀酰上的CoA基團(tuán)轉(zhuǎn)移到乙酰乙酸上。乙酰乙酸酯是酮體的化合物之

6、一。酮體由肝臟產(chǎn)生的，并通過(guò)血流轉(zhuǎn)運(yùn)至肝外組織，如心臟和大腦，被用作為生物體新陳代謝的一種能量。在這些肝外組織的線粒體中，SCOT蛋白催化反應(yīng)生成乙酰乙酰CoA，乙酰乙酰CoA經(jīng)硫解酶轉(zhuǎn)化生成乙酰輔酶A。然后乙酰輔酶A再進(jìn)入三羧酸循環(huán)為生物體新陳代謝提供能源。生物體內(nèi)SCOT蛋白缺失會(huì)引起酮酸中毒。SCOT蛋白結(jié)合CoA后形成一個(gè)中間過(guò)渡態(tài)產(chǎn)物來(lái)催化反應(yīng)的進(jìn)行。通過(guò)WilliamJencks對(duì)豬心臟SCOT蛋白的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酰輔酶

7、A上的CoA基團(tuán)與SCOT蛋白上305位點(diǎn)上的谷氨酸殘基結(jié)合，形成一個(gè)酸酐的中間體。然而，目前對(duì)于黑腹果蠅中的CoA轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)研究很少。所以，我們構(gòu)建了黑腹果蠅中的CoA轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)質(zhì)粒ScotHis—TEVpET28a，重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，目的蛋白通過(guò)NiNTA親和層析以及superdex200凝膠過(guò)濾層析等蛋白純化方法獲得了純度超過(guò)95％且均一性較好的目的蛋白。通過(guò)坐滴氣象擴(kuò)散法，采用HamptonResear