黑腹果蠅SCOT蛋白的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、琥珀酰輔酶A(:)3-羰基酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT;EC2.8.3.5)在酮體代謝過程中發(fā)揮作用，是這一過程的限速酶。截至目前，大量的研究表明SCOT在哺乳動(dòng)物中存在于細(xì)胞的線粒體中，在線粒體內(nèi)發(fā)揮催化作用。酮酸中毒是病理性的，體內(nèi)酮體的濃度可以作為檢測(cè)是否是酮酸中毒的標(biāo)志。酮酸中毒的情況下，人體無法足夠地控制酮類的產(chǎn)生，體內(nèi)酮體過多無法得到利用堆積在體內(nèi)導(dǎo)致血液的pH極大地下降，嚴(yán)重時(shí)可致使人昏迷甚至導(dǎo)致死亡。包括人類、豬心臟、羊的腎

2、臟、鼠腦中的CoA轉(zhuǎn)移酶已得到了研究，轉(zhuǎn)移酶發(fā)生作用的機(jī)制是乒乓機(jī)制。我們對(duì)模式生物黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）體內(nèi)的琥珀酰CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了研究。我們首先對(duì)黑腹果蠅中該蛋白進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，通過預(yù)測(cè)結(jié)果截掉了該蛋白氮端的33個(gè)氨基酸，這些氨基酸在二級(jí)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為無規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)，不利于晶體的生長(zhǎng);因此我們構(gòu)建了pET28a-his-TEV-CG1140(34-516aa)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Esc

3、herichia coli）BL21(DE3)菌株表達(dá)蛋白，通過親和層析及凝膠排阻層析純化了黑腹果蠅中的SCOT(DmSCOT)蛋白，利用氣象擴(kuò)散坐滴法得到了該蛋白的晶體，經(jīng)過X-ray衍射數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理后解析了該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。我們獲得的DmSCOT蛋白的晶體分辨率是2.64(A)，空間族群屬于P212121，單位晶包的參數(shù)是a=76.638，b=101.921，c=122.457，α=β=γ=90°。DmSCOT擁有典型的SCO

4、T蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，即采用了開放的α/β折疊。DmSCOT的單體由N末端(1-247aa)和C末端(259-484aa)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都含有α/β/α模式，結(jié)構(gòu)的中間部分是7條β折疊片。二聚體的分子表面涉及了兩個(gè)單體分子的63個(gè)氨基酸殘基，生物學(xué)相關(guān)的DmSCOT的二聚體表面有疏水相互作用和一些β折疊片間形成的氫鍵。共有十二個(gè)氫鍵參與相互作用，包括單體上的氨基酸殘基如下:Glu104，Arg107，Gly110，Ala111，Ly

5、s186，Arg189，Asp218，His221，Arg353 and His356;很多疏水作用和一些鹽鍵也參與穩(wěn)定了二聚化表面。DmSCOT第307位的谷氨酸相當(dāng)于豬心臟SCOT蛋白的第305位谷氨酸殘基，這一位點(diǎn)在SCOT蛋白中是相當(dāng)保守的活性位點(diǎn)。DmSCOT和豬心臟SCOT蛋白在幾個(gè)環(huán)的結(jié)構(gòu)上存在構(gòu)象的不同。最明顯的不同是DmSCOT的第125-157位的氨基酸序列，這一序列形成了額外的三個(gè)β發(fā)夾結(jié)構(gòu)。豬心臟SCOT和DmS