黑腹果蠅基因間區(qū)microRNA基因的轉(zhuǎn)錄和啟動(dòng)子分析.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類分布廣泛，大小約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，參與蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前，對(duì)miRNA基因轉(zhuǎn)錄的了解仍十分有限，一般認(rèn)為內(nèi)含子區(qū)域的miRNA及其與宿主基因共轉(zhuǎn)錄，而基因間區(qū)的miRNA則獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，擁有自己的啟動(dòng)子。本論文主要研究黑腹果蠅Drosophila melanogaster基因間區(qū)miRNA的轉(zhuǎn)錄，解析miRNA的基因結(jié)構(gòu)，檢測(cè)miRNA的基因啟動(dòng)子活性，搜尋啟動(dòng)子區(qū)moti

2、f并進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件的評(píng)估。本項(xiàng)研究對(duì)更好地理解復(fù)雜的miRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，具有重要的意義。
　　 一、果蠅基因間區(qū)pri-miRNA基因的擴(kuò)增及全長(zhǎng)克隆
　　 采取“開(kāi)源節(jié)流”策略，應(yīng)用RNAi技術(shù)干擾pri-miRNA加工成熟的關(guān)鍵核酸酶Drosha，輔以CuSO4刺激，達(dá)到了提高pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本豐度的目的。進(jìn)一步利用RACE技術(shù)克隆果蠅基因間區(qū)pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本，獲得bantam、mir-2

3、76a、mir-277和mir-8的5'末端，其中mir-276a和mk-277均含有兩個(gè)TSS，而mir-8的2個(gè)不同的5’RACE克隆具有選擇性剪接，指向同一個(gè)5’末端；同時(shí)克隆到bantam、mir-2b-1、mir-10、mir-276a和mir-277的3’末端，且mir-10具有兩個(gè)poly（A）尾巴。通過(guò)以上工作，拼接出pri-bantam、pri-mir-276a、pri-mir-277的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。
　　 二、

4、果蠅pri-miRNA的基因結(jié)構(gòu)
　　 經(jīng)過(guò)end-to-end PCR驗(yàn)證.結(jié)果表明pri-bantam全長(zhǎng)2054nt.轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）“G”距離pre-bantam的5’末端992nt，而且意外的是pri-bantam含有5個(gè)內(nèi)含子，pre-bantam位于第一個(gè)長(zhǎng)內(nèi)含子中，第四個(gè)內(nèi)含子也保留子pri-bantam轉(zhuǎn)錄本。另外，pri-mir-276a和pri-mir-277轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)分別1632nt和1300nt，

5、并且均含有多個(gè)5’末端?？寺〉乃?’端都包含一串連續(xù)“A”，并有多聚腺苷酸加尾信號(hào)（polyA signal，AATAAA）。此外，mir-8的5’端含有一個(gè)選擇性剪切的內(nèi)含子，mir-10具有多個(gè)polyA尾巴。以上特征都是典型的RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）轉(zhuǎn)錄基因的特征，這暗示pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本是由polⅡ轉(zhuǎn)錄而來(lái)。
　　 三、果蠅miRNA基因核心啟動(dòng)子的錨定及活性分析
　　 初步分析表

6、明，pri-bantam上游27bp處有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的TATA盒子，而mir-276a、mir-277和mir-8不具有這個(gè)結(jié)構(gòu)。Pri-mir-276a和pri-mir-277的兩個(gè)TSS，意味著可能有兩個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)。利用非磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ的抗體（anti-PolⅡa，8WG16）進(jìn)行體內(nèi)的染色質(zhì)免疫共沉淀分析（Chromatin Immunoprecipitation assay，ChIP）。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些miRNA的核

7、心啟動(dòng)子區(qū)可以被RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）結(jié)合。進(jìn)一步，將miRNA基因（mir-276a，bantam）的核心啟動(dòng)子克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體上游，并轉(zhuǎn)染至果蠅S2細(xì)胞中，結(jié)果表明啟動(dòng)子能成功驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因的表達(dá)，顯示出polⅡ啟動(dòng)子活性，表明大部分miRNA是由polⅡ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的。
　　 四、果蠅miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合預(yù)測(cè)及轉(zhuǎn)錄因子Myc免疫共沉淀分析
　　 實(shí)驗(yàn)的方法找到了果蠅miRNA基因的啟動(dòng)子

8、，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（Transcription Factors Binding Sites）。一些與果蠅發(fā)育調(diào)控相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子也可能參與到調(diào)控miRNA基因的表達(dá)，如Kruppel，Hunchback，Giant和Zeste被預(yù)測(cè)在bantam的核心啟動(dòng)子區(qū)。同時(shí)miRNA可能會(huì)被一些共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。另外，針對(duì)癌基因c-Myc轉(zhuǎn)錄因子，用抗c-Myc抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，

9、結(jié)果顯示c-Myc可以結(jié)合到bantam、mir-277和mir-8的啟動(dòng)子區(qū)，但是不能結(jié)合到mir-276a的啟動(dòng)子區(qū)，表明c-Myc的確可能參與調(diào)控眾多miRNA基因的表達(dá)。
　　 五、pri-miRNA基因的motif與啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件評(píng)估
　　 尋找miRNA基因的順式調(diào)控元件（cis-regulating elements），有助于鑒別miRNA基因的特征。運(yùn)用生物信息軟件分析了miRNA基因上游的motif，并

10、將找到的這些motif和已知的TRANSFAC及JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)做了比較，表明miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)motif可能具有調(diào)控miRNA基因表達(dá)的重要功能。目前啟動(dòng)子/TSS預(yù)測(cè)軟件大都是針對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的，尚未有針對(duì)miRNA基因的軟件或算法。綜合已報(bào)道證實(shí)的線蟲(chóng)、大鼠、小鼠、人等其他物種pri-miRNA基因序列，對(duì)目前使用比較廣泛的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件McPromoter，TSSG，TSSW，Promoter2.0，PromoterSc