黑腹果蠅DOA蛋白激酶與底物eEF1Bγ和SRm160相互作用的研究.pdf

1、Darkener of apricot(Doa)是果蠅基因組中編碼LAMMER激酶的唯一位點。因其在哺乳動物存在4個同源蛋白(CLK14)，LAMMER激酶也被稱為CLK激酶。關(guān)于LAMMER激酶的功能了解最清楚的是它可能磷酸化SR和類SR蛋白，通過調(diào)控果蠅體細胞性別決定信號通路中關(guān)鍵因子doublesex的選擇性剪接，從而控制果蠅的性別分化。本研究確定了eEF1Bγ和SRm160為DOA激酶的磷酸化底物，并進一步研究這兩種蛋白與DOA

2、蛋白激酶的相互作用及在其果蠅發(fā)育中的作用，擴充了LAMMER激酶參與調(diào)控的生理功能。
　　 通過酵母雙雜交，發(fā)現(xiàn)果蠅eEF1Bγ(翻譯延長因子1Bγ)與DOA激酶存在相互作用。關(guān)于eEF1Bγ基因的研究主要集中在低等生物，在果蠅及更高等的真核生物中，未見相關(guān)研究。果蠅eEF1Bγ蛋白C端的絲氨酸294極為保守，可能是LAMMER激酶的磷酸化位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)實驗中eEF1Bγ都能夠被LAMMER激酶磷酸化，并通過點

3、突變的方法確定了該磷酸化位點。本研究通過免疫熒光組化的方法確定該蛋白在果蠅胚胎發(fā)育中的表達及分布情況，并在蛹期的細胞核提取物中檢測到該蛋白的存在。該位點的無義突變造成果蠅隱性致死，說明eEF1Bγ蛋白在果蠅中擔負重要的生理功能。為了進一步揭示eEF1Bγ中DOA磷酸化的作用，我們構(gòu)建了野生型載體和磷酸化位點被突變的突變載體，結(jié)果證實該磷酸化位點的缺失降低了蛋白的活性，因為誘導轉(zhuǎn)化的野生型基因位點表達可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)在的純合無義等位基因的致死性

4、，而該磷酸化位點突變后，誘導表達的蛋白只能在一定程度上逆轉(zhuǎn)致死性。
　　 在mRNA前體組成型和選擇性拼接過程中SRm160都是必不可少的作用因子，另外SRm160還參與mRNA前體3'端加工。SRm160蛋白含有多個可能的LAMMER激酶的作用位點。本研究通過原位雜交和免疫組化的方法，研究了SRm160 mRNA和蛋白質(zhì)在胚胎中的表達及分布。SRm160基因活性的喪失及高表達對果蠅都具致死性。另外器官特異性的誘導SRm160高

5、表達與RNAi導致多種的器官的發(fā)育異常。高表達SRm160導致果蠅復(fù)眼結(jié)構(gòu)嚴重異常和雄性生殖器結(jié)構(gòu)異?；蛲耆笔坌陨称骱透亻T。而DOA位點的突變抑制高表達在復(fù)眼中導致的突變表型，但增強在生殖器中高表達導致的表型，該結(jié)果顯示在不同器官中，不同的信號通路參與SRm160和DOA的相互作用。此外，Doa突變可以造成雌果蠅出現(xiàn)不同程度的雄性化特征，而SRm160無義突變基因增強Doa突變誘導的這種性別逆轉(zhuǎn)表型。該結(jié)果表明SRm160可能也是