喹賽多與其靶蛋白hnRNP A2-B1相互作用研究.pdf

1、喹賽多是喹噁啉類化合物飼料添加劑，兼有抑菌及促生長(zhǎng)功效，且安全低毒、用藥后迅速吸收及消除、殘留期短、無(wú)蓄積，在畜牧生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)連續(xù)親和層析實(shí)驗(yàn)和生物質(zhì)譜技術(shù)初步篩選出喹賽多在人正常肝細(xì)胞HL-7702（L-02）內(nèi)的特異結(jié)合蛋白為核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1），并且用分子對(duì)接軟件預(yù)測(cè)出它們之間的結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)ys(101)、Arg(102)和Ala(105)。但是喹賽多與hnRNP A2

2、/B1的具體相互作用及它們結(jié)合后引起的生物學(xué)效應(yīng)并沒(méi)有得到確證和研究，而喹賽多與靶蛋白之間作用位點(diǎn)、親和力的研究對(duì)于弄清楚其藥理機(jī)制具有重要的意義。本課題將通過(guò)體外重組表達(dá)hnRNP A2/B1蛋白及其突變蛋白，進(jìn)行表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)(SPR)，研究喹賽多與hnRNP A2/B1之間的結(jié)合特性，并通過(guò)RNA干擾實(shí)驗(yàn)（RNAi）研究hnRNP A2/B1對(duì)喹賽多調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響，分析喹賽多促生長(zhǎng)的作用機(jī)理。
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3、.喹賽多與hnRNP A2/B1的相互作用
　　針對(duì)分子對(duì)接中預(yù)測(cè)的喹賽多與hnRNP A2/B1的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)，根據(jù)氨基酸定點(diǎn)突變?cè)瓌t分別將其突變?yōu)锳la(101)、Ala(102)和Gly(105)。構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hnRNP A2/B1、Lys101Ala、Arg102Ala、Ala105Gly，通過(guò)大腸桿菌體外大量表達(dá)目的蛋白，利用His-tag親和Ni柱

4、純化目的蛋白并用Western blot技術(shù)驗(yàn)證后，與喹賽多進(jìn)行SPR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)多循環(huán)方法檢測(cè)到喹賽多與hnRNP A2/B1及突變蛋白R(shí)(R101A)和A(A102G)都能結(jié)合，具有濃度依賴性。同時(shí)喹賽多與野生型hnRNP A2/B1的親和力要強(qiáng)于突變蛋白，因此Arg(102)對(duì)其結(jié)合有一定的影響，而對(duì)Lys(101)進(jìn)行突變后蛋白與喹賽多完全失去相互作用，說(shuō)明Lys(101)直接參與了喹賽多與hnRNP A2/B1的結(jié)合，是一個(gè)關(guān)鍵

5、的結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.喹賽多作用L-02細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)
　　通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)抑制L-02細(xì)胞內(nèi)的hnRNP A2/B1后，用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)喹賽多作用前后hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21 mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將L-02細(xì)胞內(nèi)hnRNP A2/B1干擾后5種基因的mRNA表達(dá)水平均有顯著性下調(diào)，說(shuō)明在L-02細(xì)胞內(nèi)這4種基因與hnRNPA2/B1關(guān)系密切。同時(shí)，使

6、用2μM喹賽多孵育L-02細(xì)胞1h后，空白加藥組與干擾加藥組之間各基因表達(dá)相比均有顯著性差異，說(shuō)明hnRNP A2/B1對(duì)喹賽多調(diào)節(jié)下游基因有重要的作用。結(jié)合SPR實(shí)驗(yàn)結(jié)果喹賽多在體外能直接與hnRNP A2/B1結(jié)合，推測(cè)喹賽多在L-02細(xì)胞內(nèi)也很有可能通過(guò)與hnRNPA2/B1結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。
　　用2μM喹賽多孵育L-02細(xì)胞1h后，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)到hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21的

7、mRNA水平均有顯著性的上調(diào)，可以推測(cè)喹賽多作用于L-02細(xì)胞后，與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)的mki-67和c-myc的mRNA水平隨著hnRNPA2/B1的上調(diào)而上調(diào)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)的ccnd2及p21等基因出現(xiàn)了負(fù)反饋調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞生長(zhǎng)的速度。
　　綜上所述，本課題通過(guò)SPR和RNAi實(shí)驗(yàn)研究了喹賽多與hnRNP A2/B1的相互作用和喹賽多作用細(xì)胞后引起的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1在體外能與喹

8、賽多直接結(jié)合，且Lys(101)是其相互作用中的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，Arg(102)則對(duì)hnRNPA2/B1與喹賽多的結(jié)合有一定的影響。喹賽多作用于L-02細(xì)胞后，與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)的mki-67和c-myc的mRNA水平隨著hnRNP A2/B1的上調(diào)而上調(diào)，可能使細(xì)胞增殖加快。同時(shí)為了保持細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，避免出現(xiàn)異常的過(guò)度增殖，與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)的ccnd2及p21基因出現(xiàn)了負(fù)反饋調(diào)節(jié)，減緩細(xì)胞增殖的速度。因此，喹賽多作用于