蛋白激酶B底物AS160在有氧運動改善胰島素抵抗過程中的作用.pdf

1、目的：
　　通過高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠以建立胰島素抵抗（IR）動物模型，觀察正常飲食小鼠和IR小鼠在安靜/有氧運動后骨骼肌細胞蛋白激酶B（PKB/Akt）及其下游效應因子Akt底物蛋白160（AS160）和葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）基因和蛋白表達的變化，探討Akt/AS160信號通路在IR發(fā)生中的作用，以及有氧運動對IR小鼠骨骼肌細胞Akt/AS160信號通路和GLUT4轉(zhuǎn)運的影響，并探究其分子生物學機制，以期為揭示有氧

2、運動防治IR及其相關代謝性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）IR動物模型的建立：4周齡雄性C57BL/6小鼠80只，經(jīng)過適應性喂養(yǎng)一周，隨機分為正常飲食和高脂飲食組（每組各40只），分別飼以正常飼料和高脂飼料。喂養(yǎng)10周后，檢測相關指標以鑒定 IR模型是否成功。待模型建立后，再次將正常飲食組隨機分為正常飲食安靜組（NC）和正常飲食運動組（NE）；高脂飲食組隨機分為高脂飲食安靜組（HC）和高脂飲食運動組（HE）；

3、>　?。?）運動方案：各運動組小鼠進行為期6周、75％VO2max強度的有氧跑臺訓練，1次/天，60分/次，5天/周；
　?。?）檢測空腹血清胰島素值（FINs）：取材前禁食12小時，期間自由飲水，經(jīng)腹膜下注射利多咔引以麻醉動物，采用摘眼球法取血約200μl，離心提取血清，ELISA法檢測FINs；
　　（4）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）：小鼠禁食16小時后，分別稱量體重并記錄。后經(jīng)尾靜脈取血微量，采用小型血糖儀檢測空腹血

4、糖，并將該時間點的血糖值設定為T0。隨后根據(jù)體重（10μl/g）迅速給小鼠經(jīng)口腔灌注20%葡萄糖溶液，分別檢測灌注后T15，T30，T60，T120和T180Min各時間點的血糖值；
　?。?）采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測骨骼肌細胞 Akt、AS160和GLUT4 mRNA的表達；
　　（6）采用Western blot法檢測骨骼肌細胞 Akt、AS160、GLUT4、Akt-Ser473磷酸化（pAkt-Ser47

5、3）和AS160-Thr642磷酸化（pAS160-Thr642）蛋白的表達；
　　（7）采用免疫熒光法（IF）檢測骨骼肌組織 Akt、AS160、GLUT4、pAkt-Ser473和pAS160-Thr642的表達和定位：取骨骼肌組織，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片，熒光免疫組織化學染色，共聚焦顯微鏡檢測各目的蛋白表達和定位。
　　結果：
　?。?）小鼠體重變化：HC組小鼠體重較 NC組

6、增高21.99%（P＜0.05）；HE組較HC組降低22.75%（P＜0.01）；
　?。?）FINs：飲食和運動之獨立效應及飲食和運動之交互效應對小鼠FINs均有顯著性影響。HC組小鼠FINs比NC組高77.19%（P<0.01）；而HE組比HC組FINs降低25.33%（P<0.05）；
　?。?）OGTT：高脂飲食組中，HC組小鼠OGTT的峰值比NC組明顯升高，且出現(xiàn)的時間點也明顯后移，血糖濃度在葡萄糖灌注T30 Mi

7、n恢復速度遲緩，至T180 Min時仍顯著高于基礎值。HE組與HC組相比，OGTT峰值明顯下降，出現(xiàn)的時間點前移，隨后血糖值也顯著下降，但在T180 Min時仍高于基礎值；
　　（4）骨骼肌細胞Akt2 mRNA和Akt蛋白及pAkt-Ser473蛋白表達：HC組小鼠骨骼肌細胞Akt2 mRNA（79.49±4.95 vs100.00, P<0.01）和蛋白（84.77±4.94 vs100.00, P<0.01）及pAkt-Se

8、r473（81.53±6.36 vs100.00, P<0.01）表達顯著低于NC組，而HE組小鼠骨骼肌細胞Akt2 mRNA（92.2±4.49 vs79.49±4.95, P<0.01）和蛋白（94.63±4.67 vs84.77±4.94, P<0.05）及pAkt-Ser473（98.82±4.80 vs84.77±4.64, P<0.05）表達顯著高于HC組。免疫熒光檢測 Akt蛋白和pAkt-Ser473表達趨勢與Weste

9、rn blot檢測結果基本一致；
　?。?）骨骼肌細胞AS160 mRNA和蛋白及pAS160-Thr642蛋白表達：HC組AS160 mRNA（107.89±9.44 vs100.00, P>0.05）和蛋白（109.25±8.00 vs100.00, P>0.05）與 NC組無明顯變化，而 pAS160-Thr642蛋白（69.62±7.44 vs100.00±0.00, P<0.001）的表達顯著低于NC組；HE組AS160

10、 mRNA（105.53±7.59 vs107.89±9.44, P>0.05）和蛋白（102.22±3.36 vs109.25±8.00, P>0.05）的表達較HC組也無顯著性差異，但pAS160-Thr642蛋白（85.18±6.94 vs69.62±7.44, P<0.01）的表達顯著增加。免疫熒光檢測 AS160和pAS160-Thr642蛋白表達結果支持Western blot檢測結果；
　　（6）骨骼肌細胞GLUT4

11、 mRNA和蛋白的表達：HC組GLUT4 mRNA（74.46±5.69 vs100.00, P<0.001）和蛋白（71.56±9.35 vs100.00, P<0.001）的表達明顯低于 NC組，而 HE組 GLUT4 mRNA（95.20±7.19 vs74.46±5.69, P<0.01）和蛋白（85.51±4.54 vs71.56±3.90, P<0.05）顯著高于在HC組小鼠骨骼肌組織中的表達。
　　結論：
　　

12、1．Akt/AS160信號傳導通路與高脂飲食誘導C57BL/6小鼠IR的發(fā)生密切相關；
　　2．有氧運動明顯增強 IR小鼠骨骼肌細胞 Akt、pAkt-Ser473和pAS160-Thr642的表達，并且顯著提高IR小鼠骨骼肌細胞GLUT4 mRNA和蛋白表達。由此推斷，有氧運動可能是通過增強Akt/AS160信號傳導的活性，促進骨骼肌細胞GLUT4的轉(zhuǎn)運，從而提高了骨骼肌組織中葡糖糖的代謝水平。
　　3．6周有氧運動可以顯