黑腹果蠅對甲醇的解毒代謝及行為反應.pdf

1、植物在生長發(fā)育和腐爛過程中均產(chǎn)生大量甲醇。植食性的昆蟲勢必會受到甲醇的潛在毒害。因此，這些昆蟲在進化過程中應該建立了對甲醇的解毒代謝機制及行為逃避機制。然而迄今為止，在昆蟲中僅報道了亞洲玉米螟對甲醇的解毒代謝。
　　 本論文中，我們初步探討了黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）對甲醇的解毒代謝途徑、以及包括醉酒行為、雄蠅同性求偶行為和產(chǎn)卵選擇行為在內(nèi)的多種行為反應機制。研究結(jié)果可為昆蟲進化的研究和害蟲治理措

2、施的開發(fā)提供借鑒。
　　 1.細胞色素P450單加氧酶參與幼蟲對甲醇的解毒代謝以黑腹果蠅2齡幼蟲為試蟲，分別測定了細胞色素P450單加氧酶(CYP)、過氧化氫酶、醇脫氫酶(ADHs)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和酯酶的抑制劑增效醚(PBO)、3-氨基-1，2，4-三氮唑(3-AT)、4-甲基吡唑(4-MP)、順丁烯二酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)對甲醇和甲醛的增效作用。發(fā)現(xiàn)TPP、DEM、3-AT和4-MP與甲醇的聯(lián)合作用為

3、1.02、0.98、0.98和1.00，與甲醛的聯(lián)合作用為1.15、1.05、1.08和1.14。表明甲醇或甲醛與這4種酶抑制劑是相加作用。甲醇或甲醛與PBO混用時的聯(lián)合作用分別為0.28和0.18，顯著低于1，表明甲醇或甲醛與PBO之間是增效作用，CYP參與了黑腹果蠅幼蟲對甲醇的解毒代謝。2齡幼蟲取食含有濃度為22.6、27.9和34.5 mg/g甲醇的飼料后，多功能氧化酶系的活力分別提高了3.0、3.9和2.7倍，甲醇處理也顯著上調(diào)

4、了cyp304a1、cyp9f2、cyp28a5、cyp4d2和cyp4e2基因的表達水平。表明這些基因編碼的CYP可能參與了幼蟲對甲醇的解毒代謝。
　　 2.黑腹果蠅成蟲對甲醇的解毒代謝分別測定了甲醇和5種酶抑制劑對果蠅雌蟲和雄蟲的聯(lián)合作用CI。發(fā)現(xiàn)PBO和3-AT對甲醇增效作用十分明顯;TPP和4-MP對甲醇24 h之內(nèi)為相加作用，48 h和72 h后表現(xiàn)出顯著的增效作用;而DEM與甲醇混合使用是相加作用。甲醇處理誘導了成蟲

5、多功能氧化酶系的活力，上調(diào)了數(shù)個cy基因mRNA表達。測定了幾個黑腹果蠅突變品系對甲醇的耐受能力，結(jié)果表明，ADH、α-Est7編碼基因被突變后，黑腹果蠅對甲醇耐受性下降;細胞色素P450單加氧酶基因cyp4e2、cyp9f2或cyp318a1分別被突變后，并不顯著影響黑腹果蠅成蟲對甲醇的敏感性。醛脫氫酶/辛醇脫氫酶突變品系接觸甲醇最初24 h之內(nèi)，對甲醇的耐受能力明顯增加。隨后則與CS野生品系的耐受能力相似。以上結(jié)果表明，雌蠅和雄蠅對

6、甲醇的解毒代謝過程相似，細胞色素P450單加氧酶和過氧化氫酶在甲醇的解毒過程中發(fā)揮了重要的作用;羧酸酯酶和羥脫氫酶需經(jīng)甲醇長時間持續(xù)誘導才發(fā)揮其最大的解毒能力;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶不參與甲醇的解毒代謝。醛脫氫酶/辛醇脫氫酶降解甲醇的活性仍需進一步研究。
　　 3.甲醇多代篩選對黑腹果蠅的影響黑腹果蠅CS品系累代飼養(yǎng)于含有濃度為25 mg/g甲醇的飼料上。經(jīng)40代長期篩選，果蠅對甲醇的LC50值從27.93增加到40.71 mg/g

7、。現(xiàn)實遺傳力(h2)值在篩選的前2代、3-10代和11-40代分別為0.4956、0.0315和0.0087。黑腹果蠅從卵到成蟲的發(fā)育歷期隨篩選代數(shù)的增加而延長，篩選0、2、10和40代后，在無甲醇飼料上的發(fā)育歷期分別為8.33 d、9.78 d、12.01 d和12.51 d;在有甲醇飼料上的發(fā)育歷期分別為12.59 d、14.08 d、17.37 d和18.10 d。其中胚胎和幼蟲發(fā)育期的延長尤為顯著，而蛹的發(fā)育歷期沒有顯著變化。長

8、期的甲醇篩選導致果蠅幼蟲和成蟲中數(shù)個編碼細胞色素P450單加氧酶和酯酶的基因表達量明顯升高。同時，這兩種酶的活力也顯著上升。以上結(jié)果表明，甲醇耐受性的提高具有一定的適合度代價。
　　 4.甲醇對黑腹果蠅醉酒行為的研究當緩慢接觸氣體甲醇時，果蠅表現(xiàn)出一系列的行為變化:放入的最初幾分鐘，黑腹果蠅過度興奮，運動顯著增加;接著出現(xiàn)定向困難，協(xié)調(diào)能力下降，行動遲緩，失去平衡能力，表現(xiàn)出人類相似的醉酒狀態(tài);并最終背部朝天，進入完全靜止的醉倒

9、狀態(tài)。每天1次接受甲醇熏蒸，可誘導雄蠅對甲醇的醉倒抗性，但不誘導雌蠅的抗性。酶抑制劑TPP、DEM、3-AT、4-MP和PBO預處理后，可縮短雄蠅和雌蠅對甲醇的平均醉倒時間，但對平均醉倒時間隨篩選天數(shù)的變化趨勢無影響?？梢姡x酶本身不是醉酒抗性形成的機制，而僅僅微調(diào)抗性的幅度。取食含酶抑制劑的黑腹果蠅雌蠅和雄蠅若每天接受甲醇熏蒸處理，死亡率顯著提高。雄蠅死亡率從空白對照和取食含丙酮飼料的約2％提高到10％以上，雌蠅死亡率也從對照的約5

10、％提高到10％以上。據(jù)此我們推論，甲醇代謝酶也可能存在于神經(jīng)系統(tǒng)周邊組織甚至神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，移除甲醇，從而降低甲醇的神經(jīng)毒性。
　　 5.醇類誘導的雄蠅同性求偶行為黑腹果蠅雄蟲經(jīng)歷每天1次的甲醇或乙醇重復誘導后，解除了性抑制，表現(xiàn)出積極的同性求偶行為。選擇了果蠅神經(jīng)營養(yǎng)信號途徑相關(guān)的8個基因的果蠅突變品系。發(fā)現(xiàn)Shc、drk、csw、Pi3k21B和RhoGDI編碼基因被突變后，即使在甲醇的誘導下，突變品系果蠅也不表現(xiàn)出同性求偶行為

11、;然而Rho1編碼基因被突變后，果蠅表現(xiàn)出了較高的同性求偶行為?？梢?，Shc、drk、csw、Pi3k21B、Rho1及RhoGDI介導了甲醇誘導的黑腹果蠅雄蟲同性求偶行為。據(jù)此我們認為，每天1次的甲醇重復誘導通過神經(jīng)營養(yǎng)信號途徑重塑了神經(jīng)回路，從而導致了雄蠅行為的改變。
　　 6.黑腹果蠅對甲醇的趨性水果發(fā)酵過程中，碳水化合物分解產(chǎn)生醇類揮發(fā)物，而蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生一系列揮發(fā)性的含氮化合物。利用Y型嗅覺儀分別測試了黑腹果蠅雌蟲和雄

12、蟲在饑餓/飽食狀態(tài)、交配/不交配狀態(tài)下對甲醇、乙醇和氨的嗅覺行為反應。結(jié)果顯示，交配和饑餓并不顯著改變果蠅對甲醇和乙醇的趨性，而明顯增加了果蠅對碳酸氫氨的選擇偏好性。交配和饑餓也促進了黑腹果蠅成蠅的擴散行為。雙向選擇性產(chǎn)卵實驗結(jié)果表明，野生CS品系雌蟲避免在含有甲醇和乙醇的飼料上的產(chǎn)卵，而偏愛在含有碳酸氫氨和硫化鉀的飼料上產(chǎn)卵?；蛲蛔兤废祵嶒灲Y(jié)果顯示，Or83b和Nc73EF編碼基因被突變的雌蟲不表現(xiàn)產(chǎn)卵偏好性，在醇類和胺類物質(zhì)上的產(chǎn)