EYES ABSENT和SINE OCULIS在黑腹果蠅眼睛發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、眼睛的發(fā)育和生成取決于“眼睛決定基因網(wǎng)絡(luò)”(Retinal Determination Gene Network，RDGN)，此網(wǎng)絡(luò)由高度保守的基因組成，能夠編碼對于眼睛生成必不可少的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)的輔助因子。Eya absent(Eya)和Sine oculis(So)是RDGN的重要成員，兩者可以相互結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，在果蠅乃至人類的多種發(fā)育過程中起作用，包括細(xì)胞的分化、增殖和存活等。Eya既是轉(zhuǎn)錄共激活子也是蛋白磷酸酶，而它

2、的結(jié)合蛋白So行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。已有的研究表明，eyα和so基因?qū)τ诠壍拇婊詈脱劬Φ纳墒潜仨毜?，過量表達還能誘導(dǎo)易位眼的生成。盡管eyα和so在后生動物發(fā)育中的地位如此重要，但目前對其調(diào)節(jié)及其作用的機制卻知之甚少。鑒此，我們的研究立意于從兩個方面拓展對Eya和So的認(rèn)識和了解:利用基因組拯救系統(tǒng)對Eya進行結(jié)構(gòu)一功能分析;并應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量測序(ChIP-seq)篩選So全新的靶基因。主要研究成果如下:
　　

3、 研究發(fā)現(xiàn)，Eya的酪氨酸磷酸酶活性對于果蠅的發(fā)育和存活不是必須的。果蠅的eyα基因編碼3種不同的蛋白亞型，這三種亞型都含有兩個主要的功能結(jié)構(gòu)域:高度保守的編碼271個氨基酸的碳端結(jié)構(gòu)域，即Eya Domain1(ED1);中度保守的Eya Domain2(ED2)，它存在于一個富含脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的區(qū)域(PST)中。ED1保守結(jié)構(gòu)域具有酪氨酸磷酸酶活性，體外催化活性檢測顯示小鼠和果蠅，甚至植物Eya都具有此活性。但不同的是，果蠅

4、Eya的酪氨酸磷酸酶活性很低，難以檢測。大量已有研究結(jié)果表明，Eya酪氨酸磷酸酶功能參與調(diào)節(jié)哺乳動物的發(fā)育過程。在果蠅中，相應(yīng)活性位點的突變會導(dǎo)致酪氨酸磷酸酶活性急劇下降或喪失、基于eyα cDNA的異位眼誘導(dǎo)率和遺傳拯救率大幅度降低。另外，Eya酪氨酸磷酸酶活性還參與感光細(xì)胞軸突的定位。雖然以上研究表明Eya酪氨酸磷酸酶活性可能在果蠅眼睛發(fā)育過程中行使功能，但是這一假設(shè)卻未在能精確模擬內(nèi)源eyα表達量、表達空間、表達時間上的系統(tǒng)中檢測

5、過。
　　 基于以上分析，我們構(gòu)建了3種酪氨酸磷酸酶失活型eyα基因組拯救質(zhì)粒。前兩種是單點突變，利用兩步式重組法在野生型eyα基因組拯救質(zhì)粒（eyα+GR）上引入點突變D493-N(GAT-＞AAT)和E728-Q(GAG-＞CAG)，即eyαD493N GR和eyαE728QGR。為了研究D493N、E728Q兩種點突變同時作用的效果，我們又構(gòu)建了第三個質(zhì)粒，eyαNQGR（下文中統(tǒng)稱為eyα*GR）。通過ΨC31整合酶系統(tǒng)

6、介導(dǎo)eyα基因組拯救質(zhì)粒上αttB位點和果蠅第三條染色體上αttP位點之間的重組，從而將eyα基因組拯救質(zhì)粒整合于果蠅體內(nèi)。然后通過一系列雜交，檢測在眼特異性突變eyα2（果蠅存活但是無眼）背景下和eyα無效突變eyα clillD/Df(2L)BSC356（果蠅無內(nèi)源性eyα，胚胎致死）背景下，eyα*GR對果蠅發(fā)育和存活的影響。與已有報道相悖，我們的研究結(jié)果表明，Eya的酪氨酸磷酸酶活性對于果蠅的發(fā)育和存活無影響;轉(zhuǎn)基因拯救型果蠅表

7、現(xiàn)出正常的繁殖能力、生活力、復(fù)眼內(nèi)外部表型、眼成蟲盤發(fā)育、眼對光的反應(yīng)和感光細(xì)胞軸突定位。
　　 針對Eya特異性結(jié)構(gòu)域和特定位點的結(jié)構(gòu)一功能研究已經(jīng)有所開展，并取得了初步進展。但是，以往的研究具有一定的缺陷，其主要基于cDNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)（異位眼誘導(dǎo)、熱激誘導(dǎo)等）——基因在表達的時間、空間和表達量上都與內(nèi)源基因的表達不一樣。我們的研究結(jié)論改變了人們對Eya功能已有的根深蒂固的認(rèn)識，并指出了在生物正常發(fā)育系統(tǒng)中研究基因功能的重要性

8、，也為將來Eya蛋白以及其他蛋白功能的研究提供了新思路。
　　 研究揭示，Eya的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠壍陌l(fā)育和存活是必須的。Eya的PST結(jié)構(gòu)域包含一個ED2結(jié)構(gòu)域和兩個MAPK磷酸化位點。ED2位于PST結(jié)構(gòu)域的中央位置，研究發(fā)現(xiàn)其具有蘇氨酸磷酸酶活性，能夠參與果蠅和哺乳動物固有免疫的調(diào)節(jié)，但不調(diào)節(jié)發(fā)育過程。關(guān)于MAPK磷酸化位點，最新的體內(nèi)研究表明，這兩個位點磷酸化與否對果蠅的發(fā)育和存活沒有影響。體外熒光素酶報告實驗檢測E

9、ya的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)不論是在果蠅還是小鼠中，PST結(jié)構(gòu)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄激活是必須的。另外，缺失整個PST結(jié)構(gòu)域會導(dǎo)致eyα異位眼誘導(dǎo)率急劇下降。雖然PST結(jié)構(gòu)域?qū)τ贓ya行使轉(zhuǎn)錄激活功能十分重要，缺失會影響果蠅異位眼發(fā)育，但是此結(jié)構(gòu)域卻未在正常發(fā)育系統(tǒng)中檢測過。
　　 基于以上分析，我們利用一步重組法構(gòu)建了PST結(jié)構(gòu)域缺失型eyα基因組拯救質(zhì)粒，簡稱eyαΔPST GR。與整合酪氨酸磷酸酶失活型eyα*GR一樣，通過ΨC31整合酶系統(tǒng)

10、，將eyαΔPSTGR插入果蠅第三條染色體的αttP位點上。然后，通過一系列雜交實驗，檢測在眼特異性突變eyα2背景下和eyα無效突變 eyclillD/Df(2L) BSC356背景下eyαΔPST GR對果蠅發(fā)育和存活的影響。我們的基因組DNA拯救實驗和FRT-FLP嵌合克隆分析結(jié)果表明，eyαΔPST GR無法拯救eyα眼特異性突變和無效突變。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示突變基因eyαΔPST在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上都

11、有表達，另外免疫組化染色表明檢測的時間點越早，蛋白表達水平越接近野生型。這說明拯救失敗并不是Eya蛋白無表達造成的，而是由于PST結(jié)構(gòu)域缺失造成的。換言之，eyα的PST轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠壍拇婊詈桶l(fā)育是必須的。
　　 研究表明，So參與調(diào)節(jié)與果蠅眼睛發(fā)育相關(guān)的多個基因。轉(zhuǎn)錄因子So是被廣為認(rèn)可的Eya結(jié)合蛋白，So是SIX(Sine oculis homebox)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，存在于所有的后生動物中并行使重要功能，

12、它具有2個保守結(jié)構(gòu)域:199個氨基酸的SIX結(jié)構(gòu)域(SD)，參與調(diào)節(jié)蛋白間互作;60個氨基酸的DNA結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域(HD)。在果蠅中，So對于果蠅的存活、精子發(fā)生和整個視覺系統(tǒng)（包括眼睛、視葉、幼蟲的視覺器官）的發(fā)育是必不可少的。盡管So地位重要，我們對其直接作用的靶基因卻知之甚少，大多數(shù)己知的So靶基因都能編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與眼睛發(fā)育。
　　 為了更好地了解So調(diào)節(jié)眼睛發(fā)育的機制，我們聯(lián)合染色質(zhì)免疫共沉淀和高通量測序(ChI

13、P-seq)，通過對三齡期眼成蟲盤上DNA與So蛋白相互作用的全基因組分析，我們發(fā)現(xiàn)了7566個So富集區(qū)域，大約5400個基因，其中也包括已經(jīng)被報道的So靶基因。另外，qPCR結(jié)果也再次驗證了So ChIP-seq指出的靶基因。應(yīng)用基因本體論(GO)進一步分析這些So結(jié)合基因并從中選取了一部分與眼睛發(fā)育相關(guān)的基因，通過ey-flp/FRT技術(shù)對它們的突變型進行分析，最后篩選出了8個全新的So靶基因。
　　 這8個靶基因的基因突

14、變顯示出不同的眼表型，有的是粗糙眼，但是眼睛大小無變化;有的是幾乎整個眼睛都缺失——這反映了So參與眼睛發(fā)育的多個階段，從細(xì)胞存活到MF的發(fā)生和發(fā)展。這些靶基因如下:2個編碼RNA加工蛋白的基因（omd和Syp）;2能夠編碼個轉(zhuǎn)錄因子的基因(CG8108 and l(3)j2D3）;1個編碼RabGGT亞基（調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運輸）的基因(CG12007);1個編碼跨膜轉(zhuǎn)運蛋白的基因(blot);2個編碼未知功能Armadillo-like