Ikaros家族蛋白異源表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)研究.pdf

1、白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性疾病，目前在我國(guó)具有較高的發(fā)病率和死亡率，而且發(fā)病率還在不斷攀升，因此與白血病發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制的研究備受關(guān)注。Ikaros家族蛋白是主要分布在血細(xì)胞中的一類轉(zhuǎn)錄因子蛋白，可調(diào)控血細(xì)胞分化發(fā)育中多種重要基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對(duì)多種血細(xì)胞，尤其是淋巴系白細(xì)胞的發(fā)育有著重要影響。它們的表達(dá)或功能異常與多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤高度相關(guān)。Ikaros家族蛋白的N端和C端各具有一組C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域:N端部分的四個(gè)鋅指主要負(fù)責(zé)

2、結(jié)合特定的DNA序列;而C端的兩個(gè)鋅指參與介導(dǎo)蛋白蛋白之間的相互作用，并對(duì)N端功能和蛋白壽命起到一定的調(diào)控作用。Ikaros家族蛋白可以從染色體、核小體、RNA聚合酶三個(gè)層面，通過(guò)直接結(jié)合目的基因的調(diào)控元件、招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物以及將目的基因調(diào)控區(qū)域募集至細(xì)胞核異染色質(zhì)區(qū)域等方式，調(diào)控下游蛋白的轉(zhuǎn)錄。其中，C端鋅指介導(dǎo)的蛋白蛋白相互作用對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的完成起重要作用。本論文選取該家族的Ikaros和Aiolos的C端保守部分作為研究對(duì)象，進(jìn)

3、行質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)、純化及初步的晶體學(xué)研究。已獲得的研究結(jié)果包括:1.通過(guò)分子克隆的方法成功構(gòu)建了多種表達(dá)質(zhì)粒。在原核系統(tǒng)中，質(zhì)粒攜帶的編碼基因能夠表達(dá)出含有不同長(zhǎng)度柔性連接區(qū)域的MBP融合蛋白，且經(jīng)酶切驗(yàn)證，各融合蛋白呈現(xiàn)不同的酶切效果;2.根據(jù)目的蛋白的特異標(biāo)簽親和性、表面電荷、疏水性、分子量及分子形狀等特征，采取不同的層析方式分別對(duì)MBP-IkarosC/AiolosC及Ikaros/Aiolos的C端蛋白進(jìn)行分離純化，獲得了大量高

4、純度的MBP-IkarosC/AiolosC融合蛋白;3.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明Ikaros/Aiolos的C端蛋白可能與層析填料基質(zhì)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致目的蛋白難于洗脫純化;4.針對(duì)MBP-IkarosC/AiolosC篩選得到多個(gè)潛在的晶體生長(zhǎng)條件，完成初步條件優(yōu)化，可重復(fù)性很強(qiáng)，目前實(shí)驗(yàn)仍在繼續(xù)進(jìn)行中。
　　論文的另一部分對(duì)雙孔鉀離子通道TREK1進(jìn)行了研究。該蛋白主要分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中。TREK1屬于機(jī)械門控性鉀離子通道，同

5、時(shí)受到化學(xué)或生理性刺激，包括脂質(zhì)、磷酸化、溫度、pH值等多種因素的調(diào)節(jié)。它在體內(nèi)具有重要的生理意義，與神經(jīng)保護(hù)、疼痛、麻醉、抑郁癥等具有一定的相關(guān)性。哺乳動(dòng)物雙孔鉀離子通道TREK1亞群以二聚的形式發(fā)揮功能，其單體具有典型的結(jié)構(gòu)特征:4個(gè)跨膜片段(M1～M4)，2個(gè)孔道區(qū)域(2P)，胞漿內(nèi)側(cè)有較短的氨基端和較長(zhǎng)的羧基端。有報(bào)道稱，TREK1 C端部分是各種因素調(diào)控TREK1活性的一個(gè)重要部位。本論文以TREK1的C端蛋白部分作為研究對(duì)象

6、，進(jìn)行了一系列分子克隆、表達(dá)、純化及初步晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)。目前，利用pET28a、pET30a、pMAL、pFN18a等載體，分別連接不同長(zhǎng)度TREK1C截短片段的編碼基因，已成功構(gòu)建11種表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，篩選出表達(dá)較好且融合蛋白可溶性較高的pMAL-TREK1C質(zhì)粒進(jìn)行大量表達(dá)。選用MBP親和層析及分子篩對(duì)MBP-TREK1C進(jìn)行分離純化，最終得到足量且純度較高的融合蛋白。使用Index及Wizard兩種結(jié)晶試劑盒進(jìn)行晶體條件的