糖皮質(zhì)激素受體共伴侶蛋白FKBP51通過(guò)線粒體自噬調(diào)節(jié)小鼠CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 糖皮質(zhì)激素受體共伴侶蛋白FKBP5通過(guò)線粒體自噬調(diào)節(jié)小鼠CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化。
　　目的：肝臟纖維化是由于肝臟纖維過(guò)度沉積、增生和降解失衡的結(jié)果，是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。雖然肝纖維化發(fā)病率高，但目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，并且沒(méi)有根本有效的抗纖維化治療藥物。本論文在成功創(chuàng)建FKBP5基因敲除小鼠肝臟纖維化模型的基礎(chǔ)上，探究F

2、KBP5在肝臟纖維化發(fā)生中的作用，以期望尋找預(yù)防和治療肝臟纖維化的新靶點(diǎn)。
　　方法：將野生型(WT)小鼠共6只平均分為兩組:正常對(duì)照組(WT-CON)和CCl4處理組(WT-CCl4);Fkbp5 KO小鼠共6只平均分為兩組，正常對(duì)照組(KO-CON)和CCl4處理組(KO-CCl4)。1)肝臟病理學(xué)分析。對(duì)四組小鼠肝臟切片，通過(guò)Masson染色方法，對(duì)膠原沉積進(jìn)行染色，觀察WT和KO小鼠肝臟組織病理學(xué)差異;2）利用免疫熒光染色

3、實(shí)驗(yàn)，對(duì)纖維化標(biāo)志分子α-SMA、TIMP1、CollagenⅠ進(jìn)行檢測(cè)，從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)肝臟纖維化發(fā)生程度;3）利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)纖維化相關(guān)標(biāo)志分子CollagenⅠ、TIMP1、MMP2、CTGF、TGF-β、α-SMA在mRNA水平的表達(dá)情況，檢測(cè)這四組小鼠肝臟纖維化發(fā)生情況;4）TGF-β信號(hào)通路分析。通過(guò)Real-time PCR和Western Blot的分子實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)TGF-β信號(hào)通路標(biāo)志性分子的

4、表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。5）對(duì)線粒體形態(tài)變化。對(duì)四組小鼠肝臟組織的電鏡拍照，利用軟件對(duì)每個(gè)線粒體的面積進(jìn)行測(cè)量，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5處理，分析線粒體大小變化顯著性差異，并通過(guò)電鏡觀察線粒體自噬情況;6）利用Western Blot技術(shù)對(duì)線粒體自噬相關(guān)蛋白parkin以及pink1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè);7）RNA表達(dá)譜測(cè)序分析。分別提取四組小鼠肝臟組織的RNA，利用第二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)WT/KO-CON以及WT/KO-CCl4四組的

5、RNA進(jìn)行測(cè)序分析，探究FKBP5 KO小鼠和WT小鼠對(duì)照組和注射CCl4后的基因表達(dá)情況以及對(duì)其差異基因進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：1）通過(guò)Masson染色觀察肝臟組織的病理變化發(fā)現(xiàn):CCl4處理組在匯管區(qū)均出現(xiàn)綠色的膠原沉積現(xiàn)象，并且FKBP5 KO小鼠的膠原沉積程度要輕于WT小鼠;2)利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)α-SMA、TIMP-1、CollagenⅠ三種肝臟纖維化發(fā)生的標(biāo)志分子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，三種蛋白在CCl4處理組的表達(dá)

6、量均升高，同時(shí)KO-CCl4組的表達(dá)量要低于WT-CCl4組;3）進(jìn)一步通過(guò)Real-time PCR技術(shù)對(duì)幾種肝臟纖維化發(fā)生的標(biāo)志分子在mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比較，CCl4組的α-SMA、TIMP-1、CollagenⅠ、CTGF以及TGF-β1這五種分子在mRNA的表達(dá)顯著上調(diào);而MMP2的表達(dá)被下調(diào);4）利用Western Blot和Real-time PCR技術(shù)對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子檢測(cè):纖維

7、化正調(diào)控因子TGF-β1、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad2/3、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ以及負(fù)調(diào)控因子Smad2、Smad7在WT-CCl4組中的表達(dá)均高于KO-CCl4，這一結(jié)果表明WT-CCl4組小鼠的纖維化程度嚴(yán)重于KO-CCl4組，同時(shí)WT-CCl4組小鼠機(jī)體抵抗肝臟纖維化發(fā)生的反應(yīng)更強(qiáng);5)線粒體大小測(cè)量結(jié)果顯示，KO-CON組和KO-CCl4的肝臟線粒體分別大于WT-CON和WT-CCl4組;

8、同時(shí)肝臟電鏡結(jié)果顯示KO-CCl4組小鼠的線粒體自噬情況較WT-CCl4組嚴(yán)重;6）Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KO-CCl4組小鼠的線粒體自噬相關(guān)蛋白parkin和pink1的表達(dá)高于WT-CCl4組;7）RNA-seq分析結(jié)果表明:在WT/KO-CCl4處理組中，由于敲除Fkbp5基因，導(dǎo)致脂代謝、應(yīng)激過(guò)程、CYP450代謝以及氧化還原過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程發(fā)生改變。
　　結(jié)論：1）敲除Fkbp5基因可以抵抗CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝

9、臟纖維化;
　　2)Fkbp5基因可能通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)小鼠肝臟纖維化;
　　3)Fkbp5基因可能通過(guò)影響線粒體自噬過(guò)程影響肝臟纖維化;
　　4)RNA-seq結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)Fkbp5基因可能通過(guò)脂代謝、應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程、CYP450代謝等多個(gè)生物過(guò)程共同調(diào)節(jié)肝臟纖維化;
　　第二部分 低氧應(yīng)激對(duì)WT和FKBP5 KO小鼠成纖維細(xì)胞脂肪分化的影響及機(jī)制的探究。
　　目的：很多研究已經(jīng)證實(shí)，應(yīng)激

10、反應(yīng)與代謝調(diào)節(jié)之間具有一定的相關(guān)性，但是應(yīng)激對(duì)代謝的影響以及內(nèi)在分子機(jī)制仍不清楚。缺氧對(duì)機(jī)體是一種慢性應(yīng)激過(guò)程。FKBP5(FK506結(jié)合蛋白)作為一種應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白，在涉及到應(yīng)激反應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)中可能具有重要的作用。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是探討缺氧刺激對(duì)原代WT和FKBP5KO MEFs脂肪形成的影響以及FKBP5在缺氧條件下對(duì)脂肪形成的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：1）原代成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng):利用野生型(WT)和FKBP5基因敲除(KO

11、)小鼠的胚胎分離得到相應(yīng)的原代成纖維細(xì)胞并培養(yǎng);2）脂肪誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn):分別在常氧(21％ O2)和低氧(5％O2)條件下進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察低氧對(duì)WT和FKBP5 KO細(xì)胞成脂分化的影響;3）油紅O染色:利用油紅O對(duì)脂肪誘導(dǎo)第6天的細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察脂滴積累的多少;4）利用Western Blot檢測(cè)低氧以及脂肪誘導(dǎo)過(guò)程中FKBP5蛋白表達(dá)的變化情況;5)Real-time PCR檢測(cè)脂合成、脂降解以及能量代謝相關(guān)基因的mRNA表

12、達(dá)情況。
　　結(jié)果：1）常氧條件下，F(xiàn)KBP5 KO細(xì)胞的脂滴積累顯著少于WT細(xì)胞;2）低氧條件下，WT和KO細(xì)胞的脂滴積累較常氧條件下增多，但是KO細(xì)胞的脂滴積累仍少于WT細(xì)胞;3）Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在0到24小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)KBP5的表達(dá)隨著低氧處理時(shí)間的增加而降低;在脂肪誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)論在常氧和低氧條件下，F(xiàn)KBP5蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高在降低的變化趨勢(shì)，這表明FKBP5主要在脂肪誘導(dǎo)過(guò)程的早、中期具有促進(jìn)

13、脂滴形成的作用;4) Real-timePCR結(jié)果顯示:在低氧條件下的脂肪誘導(dǎo)分化過(guò)程中，WT MEFs的脂肪合成基因(CD36、Glut4和aP2)、脂降解基因(GDPD1和Adiponectin)以及能量代謝基因(UCP1)的表達(dá)較常氧條件被下調(diào);而FKBP5 KO MEFs的脂肪合成基因以及UCP1被上調(diào)，脂降解基因表達(dá)被下調(diào)，最終表現(xiàn)為低氧促進(jìn)了WT和FKBP5 KO MEFs的脂滴形成和積累。
　　結(jié)論：1）低氧促進(jìn)WT