糖皮質(zhì)激素調(diào)控肝臟膽汁酸代謝的研究.pdf

1、目的:糖皮質(zhì)激素由于其強(qiáng)大的抗炎作用而被廣泛使用，然而包括胰島素抵抗、骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮等副作用的存在限制了其長(zhǎng)期使用。此外，糖皮質(zhì)激素最近被認(rèn)為是肝臟膽汁酸淤積和膽囊疾病的重要影響因素，但其分子機(jī)制仍然未明。已知膽汁酸代謝平衡受核受體法尼醇X受體(FXR)和SHP的調(diào)控。在本系列實(shí)驗(yàn)中我們將重點(diǎn)探討糖皮質(zhì)激素所導(dǎo)致的膽汁酸代謝紊亂和FXR信號(hào)通路的相互關(guān)系，及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.我們檢測(cè)了Cushing綜合征

2、和肥胖患者血清中糖皮質(zhì)激素和膽汁酸水平，對(duì)比其與正常人的差異并分析其相關(guān)性;
　　2.為確定糖皮質(zhì)激素對(duì)膽汁酸平衡的影響，我們對(duì)C57BL/6小鼠給予劑量為1mg/kg的地塞米松處理后研究膽囊、肝臟、血液膽汁酸的含量;
　　3.為解決DEX導(dǎo)致的膽汁酸生成的分子基礎(chǔ)，我們對(duì)參與膽汁酸和膽固醇代謝的基因進(jìn)行了系統(tǒng)性的定量分析。并檢測(cè)了FXR、SHP等調(diào)控因子的水平。為進(jìn)一步確定糖皮質(zhì)激素在糖皮質(zhì)激素在調(diào)控SHP表達(dá)中的作用，我

3、們研究了血清糖皮質(zhì)激素和肝臟SHP表達(dá)的節(jié)律變化;
　　4.為進(jìn)一步探討GR在膽汁酸平衡中的作用，我們對(duì)db/db小鼠中采用了GR的一種拮抗劑RU486，下一步，我們通過(guò)尾靜脈給db/db小鼠注射了GR shRNA腺病毒，然后分別檢測(cè)了肝臟內(nèi)和系統(tǒng)循環(huán)中膽汁酸的積聚水平以及SHP表達(dá)、Cyp7A1與Cyp8b1表達(dá);
　　5.在HEK293T細(xì)胞糖皮質(zhì)激素和GW4064處理后行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)SHP啟動(dòng)子激活。構(gòu)建

4、并轉(zhuǎn)染GR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域丟失或者突變、GR DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變的質(zhì)粒后，檢測(cè)糖皮質(zhì)激素是否仍然可以抑制SHP的轉(zhuǎn)錄活性。DEX處理后，檢測(cè)GR是否轉(zhuǎn)位入核與FXR在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合。行GST下拉實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GR和FXR之間存在直接的物理性結(jié)合。行CHIP試驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞經(jīng)DEX處理后其SHP啟動(dòng)子FXRE區(qū)招募的GR是否增加;
　　6.我們用DEX和對(duì)照溶劑分別處理了FXR野生型和敲除小鼠。檢測(cè)DEX處理是否增加小鼠肝臟和血清膽

5、汁酸水平，引起肝臟SHP降低和Cyp7A1、Cyp8B1增加。在分離的原代肝細(xì)胞中我們做了相同的實(shí)驗(yàn)。此外，我們觀察了FXR野生型和敲除的肝臟細(xì)胞經(jīng)DEX處理后GR是否被招募到SHP啟動(dòng)子區(qū);
　　7.我們做了一個(gè)CHIP實(shí)驗(yàn)來(lái)尋找在HepG2細(xì)胞中GR轉(zhuǎn)錄抑制活性所需要的共抑制因子，檢測(cè)了CtBP或者SMRT在DEX干預(yù)后是否被招募到SHP的啟動(dòng)子區(qū)，使用siRNA沉默CtBP后是否可以解除DEX對(duì)SHP的抑制作用，免疫共沉淀試

6、驗(yàn)檢測(cè)CtBP是否可以與GR結(jié)合。采用了CtBP腺病毒shRNA通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)后又開始給予了7天的DEX干預(yù)處理。在注射Ad-shRNA的小鼠檢測(cè)肝臟膽汁酸濃度能否被糖皮質(zhì)激素所增加，以及肝臟SHP、Cyp7A1和Cyp8B1的相應(yīng)變化;
　　8.我們檢測(cè)了使用合成激動(dòng)劑GW4064激活FXR后是否可以保護(hù)DEX導(dǎo)致的膽汁酸過(guò)量生成和淤積。首先檢測(cè)了是否激活FXR，存在SHP增加和Cyp7A1、Cyp8B1表達(dá)的減少，肝

7、臟和血清膽汁酸水平、血清ALT、膽紅素水平在GW4064干預(yù)組能否下降。
　　結(jié)果:
　　1.Cushing綜合征和肥胖患者血清糖皮質(zhì)激素水平升高，同時(shí)這些患者的血清膽汁酸水平比正常人群對(duì)照相升高。血清糖皮質(zhì)激素水平與血清膽汁酸水平在肥胖與非肥胖人群都存在相關(guān)性;
　　2.對(duì)C57BL/6小鼠給予地塞米松處理14天后，肝重和膽囊體積均增加，血清和肝內(nèi)膽汁酸顯著上升，而血清和肝臟膽固醇水平并沒(méi)有改變。膽囊內(nèi)膽汁酸和膽固醇

8、水平在DEX處理組小鼠也增加，而磷脂濃度卻降低。血清ALT水平在DEX處理組增加，這提示了肝細(xì)胞損傷的存在;
　　3.DEX顯著增加Cyp7a1和Cyp8b1的表達(dá)，而后兩者參與了膽汁酸合成的經(jīng)典通路。FXR靶基因BSEP表達(dá)增加，它在膽汁酸向外運(yùn)輸中起重要作用，Mdr2的降低則和DEX處理組小鼠膽囊中磷脂降低有關(guān)，負(fù)責(zé)將膽汁酸向體循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)的Mrp3和Mrp4也急劇增加。我們發(fā)現(xiàn)SHP顯著減少，而FXR卻沒(méi)有改變。C57BL/6小

9、鼠表現(xiàn)出很明顯的皮質(zhì)酮水平晝夜節(jié)律，而SHP表達(dá)則是呈現(xiàn)一個(gè)相反的節(jié)律，此外，SHP mRNA的表達(dá)節(jié)律在給小鼠尾經(jīng)靜脈注射帶有GR shRNA的腺病毒后被阻斷;
　　4.肝臟和血清中膽汁酸濃度在RU486處理后明顯減少，相對(duì)應(yīng)地SHP表達(dá)上升，而Cyp7A1和Cyp8b1則下降。肝臟的GR表達(dá)量與對(duì)照組非特異性shRNA處理小鼠相比下降了70％，在GR缺陷的小鼠肝臟和系統(tǒng)循環(huán)內(nèi)膽汁酸濃度顯著下降，相一致的是，SHP表達(dá)上升，而C

10、yp7A1和Cyp8b1則下降，肝臟GR缺陷也降低了血清ALT水平;
　　5.DEX處理的HepG2細(xì)胞SHP表達(dá)下降，我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素在GW4064存在的情況下也可以有效抑制SHP的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也顯示了在HEK293T細(xì)胞中DEX可以在GW4064存在或不存在的情況下抑制SHP啟動(dòng)子激活。GR LBD的丟失或者突變會(huì)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素對(duì)SHP的轉(zhuǎn)錄抑制作用消失，而GR DBD突變之后，糖皮質(zhì)激素仍然可以抑制SHP的轉(zhuǎn)

11、錄活性。IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEX處理后，GR轉(zhuǎn)位入核，這提高了GR和FXR在細(xì)胞核內(nèi)的結(jié)合。GST下拉實(shí)驗(yàn)后來(lái)揭示了GR和FXR之間存在直接的物理性結(jié)合。而且，剔除FXR的AF2后阻斷了其與GR的結(jié)合。CHIP試驗(yàn)也顯示了HepG2細(xì)胞經(jīng)DEX處理后其SHP啟動(dòng)子FXRE區(qū)招募的GR增加;
　　6.DEX處理只增加FXR WT小鼠肝臟和血清膽汁酸水平，而在KO小鼠則無(wú)效。相應(yīng)地，DEX引起的肝臟SHP降低和Cyp7A1、Cyp8B1增加

12、也只是在FXR WT小鼠中可觀察到，而KO小鼠則無(wú)。在原代肝細(xì)胞中也是如此。此外，我們觀察到FXR野生型的肝臟細(xì)胞經(jīng)DEX處理后GR被招募到SHP啟動(dòng)子區(qū)，而FXR敲除的細(xì)胞則沒(méi)有招募;
　　7.我們發(fā)現(xiàn)CtBP而不是SMRT在DEX干預(yù)后被招募到SHP的啟動(dòng)子區(qū)。使用相應(yīng)siRNA沉默CtBP后可以解除DEX對(duì)SHP的抑制作用。CtBP在免疫共沉淀試驗(yàn)中可以GR結(jié)合。肝臟CtBPmRNA和蛋白表達(dá)在使用腺病毒-shRNA后都急劇

13、減少，注射Ad-shRNA的小鼠肝臟膽汁酸濃度不能被DEX所增加。肝臟SHP、Cyp7A1和Cyp8B1的相應(yīng)變化也可以在注射CtBP Ad-shRNA的小鼠中觀察到;
　　8.FXR合成激動(dòng)劑GW4064激活FXR后可以保護(hù)糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的膽汁酸過(guò)量生成和淤積。這種干預(yù)可以激活FXR，表現(xiàn)為SHP的增加和Cyp7A1、Cyp8B1表達(dá)的減少。此外，肝臟和血清膽汁酸水平、血清ALT在GW4064干預(yù)組也明顯下降。
　　結(jié)論: