塞來昔布通過Akt信號途徑改善CCl4誘導的小鼠肝臟纖維化.pdf

1、背景及目的：
　　肝纖維化是一種常見的慢性肝病，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，后期可發(fā)展為肝硬化及肝癌。了解肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的機制及其分子基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)有效的預防和治療肝纖維化的藥物具有極為重要的現(xiàn)實意義。
　　環(huán)氧化酶（COX）是花生四烯酸代謝的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物,從而參與機體的多種病理生理過程，其中以COX-2亞型最為重要。塞來昔布是一種選擇性的COX-2抑制

2、劑，目前作為一種抗炎鎮(zhèn)痛藥廣泛應用于臨床。已有研究表明，塞來昔布能通過COX-2依賴和非依賴途徑影響肝臟疾病如肝炎、肝纖維化和肝癌的病理過程。在BDL和TAA誘導的大鼠肝纖維化模型中，塞來昔布可減少肝臟COX-2、PPRAc、α-SMA、TGF-β1和collagenα1（I）mRNA的表達，減輕肝纖維化程度。塞來昔布還可通過發(fā)揮抗氧化作用、抑制COX-2的活力、減少TGF-β的表達、誘導金屬蛋白酶的活性、預防及逆轉(zhuǎn)膠原的沉積，從而預防

3、及逆轉(zhuǎn)CCl4誘導的大鼠肝纖維化。然而，塞來昔布對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機制還有待進一步闡明。
　　Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用，能通過多種途徑影響細胞的增殖和凋亡。MMP19基因敲除小鼠Akt的磷酸化水平較野生型小鼠高，因此在肝纖維化模型中顯示出較高的抗凋亡活力，減輕肝纖維化程度。已有報道塞來昔布可抑制肝星形細胞（HSC）Akt的活化，誘導HSC的凋亡，從而改善肝纖維

4、化，但是，塞來昔布是否作用于肝細胞的Akt信號途徑及其對肝纖維化形成的影響尚不明確。
　　本研究通過塞來昔布干預CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型，研究塞來昔布是否通過肝細胞Akt信號途徑，影響肝纖維化的發(fā)生，并深入探討其分子機制。
　　材料和方法：
　　1.建立CCl4誘導的C57BL/6小鼠肝纖維化模型。將8周齡大小的C57BL/6雄性小鼠隨機分成正常對照組、CCl4處理組、CCl4+塞來昔布處理組和CCl4+塞來昔布

5、+米替福新處理組：正常對照組腹腔注射橄欖油，10ml/kg，每周兩次，共4周；CCl4處理組腹腔注射20％CCl4橄欖油溶液，10ml/kg，每周兩次，共4周；CCl4+塞來昔布處理組在CCl4處理組的基礎(chǔ)上，加16mg/kg劑量的Celecoxib，腹腔注射，每周5次，共4周；CCl4+塞來昔布+米替福新處理組在CCl4+塞來昔布處理組的基礎(chǔ)上，加16mg/kg劑量的Miltefosine，腹腔注射，每周5次，共4周。
　　2.

6、組織學分析。將樣品用4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，用HE及Masson染色了解肝臟纖維化情況。
　　3.生化指標分析。用試劑盒檢測小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平；用 ELISA試劑盒檢測小鼠肝臟PGE2的表達情況。
　　4.蛋白免疫印跡法。檢測各處理組小鼠肝臟α-SMA、Akt和pAkt、p53、Smad3和pSmad3、ERK1/2和pERK1/2的表達情況。
　　5. TUNEL。用TUNEL試劑盒檢測各處

7、理組小鼠肝臟細胞凋亡情況。
　　6.實驗數(shù)據(jù)分析和處理。用GraphPad Prism5.0軟件，對數(shù)據(jù)使用單因素卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.塞來昔布減少CCl4誘導的肝損傷及細胞凋亡，改善肝纖維化。
　　2.塞來昔布激活CCl4處理小鼠肝臟Akt信號途徑，抑制p53的表達。
　　3. Akt抑制劑米替福新減弱塞來昔布的抗凋亡作用，加重小鼠的肝損傷及纖維化。
　　4. Akt抑制劑米