FKBP51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 FKBP51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究
　　目的:肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。雖然肝纖維化發(fā)病率高，但目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，且無有效的根本的抗纖維化治療藥物。本論文第一部分通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除小鼠肝臟纖維化模型，研究FKBP51在肝臟纖維化中的作用，以期尋找預(yù)防和治療肝臟纖維化的新的靶點(diǎn)。

2、r>　　方法:通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除(KO)小鼠肝臟纖維化模型，分析FKBP51基因的缺失對(duì)肝臟的影響。1）FKBP51基因敲除小鼠的肝臟纖維化模型創(chuàng)建。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組，分別為注射橄欖油的野生型(WT)小鼠(WT-Con)、注射橄欖油的FKBP51基因敲除小鼠(KO-Con)、注射四氯化碳的野生型小鼠(WT-CC L4)、注射四氯化碳的FKBP51基因敲除小鼠(KO-CCL4)，腹腔注射，每周三次，持續(xù)兩周;2)肝臟表觀病理觀

3、察。對(duì)肝臟取材后觀察四組肝臟的色澤、質(zhì)地以及表面光滑度;3)肝臟病理學(xué)分析。對(duì)四組小鼠肝臟切片，分別進(jìn)行HE染色，Masson染色，纖維化程度分析，來研究WT和KO小鼠肝臟組織病理學(xué)變化;4）利用Real-time實(shí)驗(yàn)，對(duì)與肝臟纖維化相關(guān)的分子進(jìn)行檢測(cè);5）免疫組化實(shí)驗(yàn)。對(duì)纖維化標(biāo)志分子進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證;6）測(cè)定細(xì)胞凋亡。對(duì)四組小鼠的肝臟切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè);7）免疫印跡實(shí)驗(yàn)。對(duì)四組小鼠肝臟組織中的自噬、代謝、TGF-β通路相關(guān)基因進(jìn)行

4、檢測(cè)。
　　結(jié)果:1）通過免疫組織化學(xué)方法鑒定證明成功構(gòu)建了WT和KO肝臟纖維化動(dòng)物模型;2）通過對(duì)肝臟表觀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):CCL4處理組中，WT小鼠肝臟色澤暗淡，質(zhì)地硬，表面粗糙，布滿小顆粒纖維化結(jié)節(jié)，而FKBP51KO小鼠肝臟色澤較淡，質(zhì)地較硬，表面較粗糙，布滿少量小顆粒纖維化結(jié)節(jié)，比野生型小鼠纖維化程度輕;3)肝臟病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn):CCL4處理組中，WT小鼠肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)可見大量纖維組織增生且炎癥細(xì)胞多，而FKBP51K

5、O小鼠炎癥細(xì)胞少且膠原沉積少;4）通過Real-time和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CollagenⅠ、TIMP1、CTGF和α-SMA等纖維化標(biāo)志蛋白在FKBP51基因敲除小鼠中的表達(dá)明顯少于野生型小鼠，且與肝臟纖維化Marker相關(guān)的細(xì)胞因子CTGF、IL6、INF-γ、TGF-β、TNF-α也出現(xiàn)此趨勢(shì);5）通過對(duì)WT和KO小鼠肝臟進(jìn)行凋亡測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP51基因敲除小鼠肝臟凋亡細(xì)胞很少，細(xì)胞中幾乎無胞核固縮、染色質(zhì)邊聚、胞核染成棕

6、黃色等凋亡現(xiàn)象，而野生型小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞;6）免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):FKBP51基因敲除小鼠自噬較WT相比明顯加強(qiáng)，而與纖維化相關(guān)的TGF-β中的通路分子在KO小鼠中明顯被抑制。
　　結(jié)論:FKBP51參與TGF-β通路介導(dǎo)的CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化過程，F(xiàn)KBP51KO小鼠抵御CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化。
　　第二部分 Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區(qū)RNA表達(dá)譜系的分析比較
　　目的:通過分析野生型小

7、鼠(WT)與Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝臟、海馬RNA表達(dá)譜系之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路和神經(jīng)通路中的作用。
　　方法:利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬mRNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用BRB-ArrayTools進(jìn)行分析，篩選出小鼠肝臟與海馬的差異基因，然后分別利用在線工具DAVID對(duì)差異基因進(jìn)行GO本體分析，STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Geneca

8、rd對(duì)基因進(jìn)行注釋。
　　結(jié)果:(1)Fkbp51的缺失，在肝臟中造成類固醇生物合成及代謝、脂類物質(zhì)代謝以及氧化還原反應(yīng)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化;(2)在海馬中造成機(jī)械刺激探測(cè)、學(xué)習(xí)或記憶、突觸傳遞的調(diào)節(jié)、PPAR信號(hào)通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化;(3)在肝臟與海馬中，F(xiàn)kbp51的缺失同時(shí)造成了11個(gè)基因的共差異表達(dá)，這11個(gè)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖顯示:HMGCS2與INSIG1及相關(guān)蛋白形成網(wǎng)絡(luò)