清化固腎排毒顆粒對(duì)腎纖維化的保護(hù)作用以及其對(duì)wnt信號(hào)通路機(jī)制的研究.pdf

1、目的:本研究通過建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction)模型，檢測(cè)wnt信號(hào)通路蛋白wnt1、β連環(huán)蛋白(β-catenin)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等蛋白及基因的表達(dá)，從而探討清化固腎排毒顆粒對(duì)腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用以及其對(duì)wnt信號(hào)通路的作用機(jī)制。
　　方法:將72只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和造模組，造模組采取單側(cè)輸尿管結(jié)扎，

2、造模后再隨機(jī)分為UUO模型組、洛丁新組、中藥組，每組SD大鼠18只。中藥組予以清化固腎排毒顆粒1.5g/kg.d溶于生理鹽水中灌胃，西藥組予以洛丁新片1.6mg/kg.d溶于生理鹽水中灌胃，假手術(shù)組和模型組予以生理鹽水灌胃，每日一次。分別于造模后的第7、14、21天時(shí)隨機(jī)處死每組中的6只大鼠，心臟取血檢測(cè)血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(serumcreatinine，SCr)、并留取梗阻側(cè)腎臟組織進(jìn)行

3、相關(guān)病理檢測(cè)。分別采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining， HE染色）和Masson染色評(píng)價(jià)腎小管損傷情況和腎間質(zhì)纖維化程度，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及Westem Blot技術(shù)檢測(cè)腎臟組織wnt1、β-catenin、α-SMA、TGF-β1的蛋白和mRNA在腎組織中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.清化固腎排毒顆粒對(duì)UUO大鼠腎臟病理的影響(1) HE染色結(jié)果:假手

4、術(shù)組未見明顯病理改變。模型組腎臟可見腎小管管腔擴(kuò)張、間質(zhì)增寬，小管上皮細(xì)胞變性、萎縮、壞死、脫落以及炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化，隨著梗阻時(shí)間延長，損傷程度進(jìn)一步加重。洛丁新組、中藥組腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、萎縮程度和間質(zhì)纖維化程度較模型組輕(P＜0.05)，腎小管損傷程度評(píng)分明顯減少(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2) Masson染色結(jié)果:在假手術(shù)組，腎組織masson染色未見明顯病理改變

5、，僅見少量線狀藍(lán)染的膠原組織。在模型組，可見腎小囊、腎小管基膜及間質(zhì)出現(xiàn)明顯藍(lán)染的膠原組織(P＜0.05)，隨著梗阻時(shí)間的延長，腎間質(zhì)中藍(lán)染的成分逐漸增多，提示纖維化程度進(jìn)行性加重。中藥組及洛丁新組Masson評(píng)分，較模型組明顯減少(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.清化固腎排毒顆粒對(duì)UUO大鼠腎功能的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠 SCr、BUN均明顯升高(P＜0.05);與模型組

6、比較，中藥組和洛丁新組SCr、BUN均明顯降低(P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.對(duì)大鼠24 hUP的影響各組大鼠24 hUP量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，隨著時(shí)間的延長，各組大鼠24 hUP量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:與假手術(shù)組比較，各模組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、β-catenin表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，隨著

7、輸尿管梗阻時(shí)間延長，各指標(biāo)程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的TGF-β1、α-SMA、β-catenin表達(dá)降低(P＜0.05); Wnt1免疫組化結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)wnt1高表達(dá)(P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1表達(dá)量最高(P＜0.05)，隨后降低，中藥組與洛丁新組比較，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與假手術(shù)組比較，各模組大鼠腎組織T

8、GF-β1mRNA、α-SMA mRNA，β-catenin mRNA表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，隨著輸尿管梗阻時(shí)間延長，各指標(biāo)程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的TGF-β1mRNA、α-SMAmRNA、β-catenin mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。Wnt1 mRNA結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，各造模組大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)wnt1 mRNA高表達(dá)(P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1mRNA表達(dá)量最高(P＜0.05

9、)，隨后降低;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠wnt1mRNA表達(dá)降低(P＜0.05);中藥組與洛丁新組比較，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　6.Westem Blot結(jié)果與假手術(shù)組比較，各模組大鼠腎組織β-catenin蛋白含量表達(dá)明顯增多（P＜0.05)，隨著輸尿管梗阻時(shí)間延長，表達(dá)程度加重;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠的β-catenin蛋白含量表達(dá)降低（P＜0.05）。Wnt1結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，

10、各造模組大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)wnt1蛋白含量高表達(dá)（P＜0.05)，在梗阻后第7天wnt1表達(dá)量最高(P0.05)，隨后降低;與模型組比較，中藥組、洛丁新組大鼠wnt1蛋白含量表達(dá)降低（P＜0.05)，中藥組與洛丁新組比較，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、成功建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎纖維化模型;
　　2、清化固腎排毒顆粒能夠?qū)UO大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，一定程度改善腎功能及腎臟病理，