Fkbp51基因在心臟發(fā)育和心臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 Fkbp51基因在心臟發(fā)育和心臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究
　　目的：
　　心臟纖維化是以心臟間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白積累為特點(diǎn)，造成心臟收縮和舒張功能不全，是許多心臟病理生理變化的前提條件。糖皮質(zhì)激素(GC)是一類由腎上腺皮質(zhì)分泌的甾體激素，不但可以通過糖皮質(zhì)激素受體(GR)調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成及代謝，而且糖皮質(zhì)激素在心血管系統(tǒng)的平衡中也具有重要作用;作為糖皮質(zhì)

2、激素受體的共伴侶蛋白，F(xiàn)KBP51蛋白參與糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)過程，因此敲除Fkbp51可能對(duì)心臟發(fā)育和心臟纖維化的發(fā)生產(chǎn)生影響。本論文通過建立Fkbp51基因敲除小鼠心臟纖維化模型，探究FKBP51在心臟發(fā)育及心臟纖維化中的作用，為探究心臟發(fā)育和研制抗心臟纖維化藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　利用實(shí)驗(yàn)室已有的Fkbp51基因敲除(KO)小鼠，通過建立心臟纖維化模型，分析Fkbp51基因在心臟纖維化過程中的作用。

3、
　　1）小鼠的心臟纖維化模型建立:將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組（每組五只），分別為皮下種植緩釋泵緩慢釋放生理鹽水的野生型小鼠(WT-control)、釋放生理鹽水的Fkbp51基因敲除小鼠（KO-contro1）、釋放異丙腎上腺素(ISO)的野生型小鼠(WT-ISO)、釋放異丙腎上腺素的Fkbp51基因敲除小鼠（KO-ISO），持續(xù)三周;
　　2）心臟超聲與心電功能檢測(cè):對(duì)以上實(shí)驗(yàn)組中小鼠麻醉后，進(jìn)行超聲與心電功能檢測(cè);
　　

4、3）心臟表觀病理分析:使用電子天平稱量實(shí)驗(yàn)小鼠心臟重量，使用相機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠心臟進(jìn)行拍照并觀察其大小和形態(tài);對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色，探究WT和KO小鼠心臟組織病理學(xué)變化;
　　4）利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)心臟纖維化相關(guān)基因mRNA水平上的變化;
　　5）利用免疫組化和免疫熒技術(shù)檢測(cè)心臟纖維化相關(guān)基因蛋白水平上的變化;
　　6）血清指標(biāo)檢測(cè)。對(duì)四組小鼠的血清進(jìn)

5、行心臟纖維化相關(guān)炎癥因子和細(xì)胞因子驗(yàn)證;
　　7）利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)（1中四組小鼠）心臟組織中纖維化標(biāo)志性蛋白、TGF-β通路相關(guān)蛋白、m-TOR通路相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　1）通過免疫組織化學(xué)方法鑒定證明成功構(gòu)建了WT心臟纖維化動(dòng)物模型，而Fkbp51KO小鼠并無明顯纖維化出現(xiàn)。
　　2）通過超聲與心電檢測(cè)，顯示Fkbp51基因敲除后，F(xiàn)kbp51KO小鼠主波電壓平均水平顯著高于WT小鼠且心率顯著減

6、慢，表明KO小鼠可能存在房室傳導(dǎo)阻滯，且KO小鼠心室肌厚度大于WT小鼠心室肌厚度，心臟發(fā)育異常。ISO處理后，超聲結(jié)果顯示，WT小鼠的射血分?jǐn)?shù)、舒張末期左室后壁厚度及左室短軸縮短率均降低，心功能顯著降低;而KO小鼠并無顯著性變化，心功能相對(duì)穩(wěn)定。心電結(jié)果顯示W(wǎng)T主波明顯變
　　深變高，KO主波變高趨勢(shì)不如WT明顯且心率明顯加快，傳導(dǎo)也加快，收縮力增強(qiáng)。3）通過對(duì)心臟表觀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):ISO處理組中，WT小鼠心臟明顯變大、變重，而F

7、kbp51KO心臟無明顯改變。
　　4）心臟病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ISO處理后，WT小鼠心臟出現(xiàn)明顯肥大，心臟壁變薄，出現(xiàn)大量纖維化;而Fkbp51基因敲除小鼠并未出現(xiàn)纖維化，且心臟壁無明顯改變。
　　5）通過Real-time PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ISO處理后Fkbp51基因顯著增加;CollagenⅠ和AngⅡ在Fkbp51基因敲除小鼠中的表達(dá)明顯少于野生型小鼠，異丙腎上腺素處理后WT小鼠出現(xiàn)顯著性升高，而KO小鼠無明顯改變;與心

8、臟纖維化Marker相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β以及TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ也出現(xiàn)此趨勢(shì)。
　　6）免疫熒光實(shí)驗(yàn)，對(duì)CollagenⅠ蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在Fkbp51基因敲除小鼠心臟中的表達(dá)明顯少于野生型小鼠;免疫組化實(shí)驗(yàn)，對(duì)α-SMA和TIMP1等纖維化標(biāo)志蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在Fkbp51基因敲除小鼠中的表達(dá)明顯少于野生型小鼠。
　　7）血清指標(biāo)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ISO處理后纖維化標(biāo)志分子小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、小鼠超氧化物歧

9、化酶、血管緊張素Ⅱ和小鼠L—乳酸脫氫酶、小鼠腫瘤壞死因子α和小鼠Y干擾素出現(xiàn)顯著性改變，而KO小鼠無明顯改變。
　　8）免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):未經(jīng)處理時(shí)，KO小鼠α-SMA蛋白、P-STAT3蛋白和mTOR蛋白表達(dá)增加，異丙腎上腺素處理后WT小鼠FKBP51蛋白表達(dá)增加，且CollagenⅠ蛋白和GR蛋白表達(dá)也增加。此外KO小鼠比WT小鼠Smad蛋白表達(dá)增加，說明TGF-β通路與此過程存在密切相關(guān)，此外異丙腎上腺素處理前后，KO小鼠m

10、TOR相關(guān)蛋白表達(dá)增加，說明mTOR蛋白與此過程密切相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　FKBP51蛋白通過與糖皮質(zhì)激素受體相互作用，參與糖皮質(zhì)激素信號(hào)傳導(dǎo)，通過TGF-β信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路調(diào)控小鼠心臟發(fā)育和由異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化的發(fā)生。
　　第二部分 心臟纖維化小鼠模型RNA表達(dá)譜系的分析比較
　　目的：
　　通過分析野生型小鼠(WT)和Fkbp51基因敲除(KO)小鼠分別使用異丙腎上腺素處理和心

11、臟左前降支結(jié)扎兩種方法構(gòu)建心臟纖維化模型前后心臟mRNA表達(dá)系譜的變化，研究Fkbp51基因在心臟發(fā)育和心臟纖維化過程中的作用。
　　方法：
　　利用第二代高通量基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)異丙腎上腺素處理和心臟左前降支結(jié)扎兩種方法構(gòu)建的纖維化模型小鼠的心臟進(jìn)行mRNA表達(dá)譜測(cè)序，將測(cè)序的數(shù)據(jù)用DEGseq進(jìn)行差異分析，限定差異條件后篩選出各組小鼠心臟的差異基因，通過測(cè)序數(shù)據(jù)各組間比較得到組間的基因火山圖，進(jìn)一步探索組間差別并做出各組的

12、熱圖，之后利用在線工具DAVID對(duì)差異基因進(jìn)行GO本體分析和KEGG通路分析，并利用Genecards對(duì)基因進(jìn)行注釋。
　　結(jié)果：
　　(1)Fkbp51的缺失主要導(dǎo)致與核糖體相關(guān)的合成與降解，通過特異性的核糖體的功能變化引起心臟的發(fā)育損傷。
　　(2)異丙腎上腺素處理后，WT小鼠呈現(xiàn)出纖維化，而KO小鼠無明顯纖維化。WT小鼠處理后PI3K-Akt信號(hào)通路出現(xiàn)明顯改變，而KO小鼠存在明顯改變的是核糖體。
　　(3

13、)左前降支結(jié)扎后，WT和KO小鼠兩組均存在纖維化，但KO小鼠會(huì)有比較高的死亡率。WT小鼠處理后主要影響酶活性劑代謝，KO小鼠主要影響酶活性和離子活性，并一定程度上影響感染相關(guān)的通路。
　　(4)KO組ISO處理后，存在顯著性改變的依然是核糖體，與Fkbp51基因敲除后的變化一致，這可能是基因敲除后影響心臟發(fā)育及ISO處理后抗纖維化的原因。
　　(5)LAD處理后，WT和KO小鼠相比，改變的主要是酶的活性變化，但KO小鼠存在較

14、高的死亡率，可能是由于氧化還原酶的變化及相關(guān)疾病的易感性。
　　結(jié)論：
　　本研究通過對(duì)Fkbp51KO與WT小鼠的心臟異丙腎上腺素和左前降支結(jié)扎兩種方法構(gòu)建心臟纖維化后的RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Fkbp51基因在心臟發(fā)育和心臟纖維化中的作用是一個(gè)多基因、多途徑、多信號(hào)通路相互作用的過程，為下一步深入研究Fkbp51基因在心臟發(fā)育和心臟纖維化中作用的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為Fkbp51在心臟疾病中可能起到的作用