丹參酮ⅡA對大鼠心臟纖維化作用及機(jī)制的研究.pdf

1、背景：心肌纖維化（MF）是影響心臟功能的常見病理改變，高血壓、心肌梗死、肺動(dòng)脈高壓、代謝綜合征、心臟瓣膜病、心律失常等疾病均可導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生，心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展又使心律失常、心力衰竭、猝死等心血管疾病的發(fā)生率增加。對于心肌纖維化的研究已有很長的歷史，目前大多學(xué)者認(rèn)為心肌纖維化是由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）（尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維）代謝異常而過度沉積導(dǎo)致。大量研究證明，在各種導(dǎo)致心肌纖維化的因素中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAA

2、S）激活占據(jù)主導(dǎo)地位，大量實(shí)驗(yàn)顯示，作為RAAS中主要的活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生，近年來隨著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）、醛固酮受體拮抗劑等藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，對心肌纖維化的防治也有了很大的進(jìn)步，但仍需進(jìn)一步的研究。近年來，隨著對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smads信號通路研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smads信號通路與心肌纖維化密切相關(guān)。TGF-β

3、1/Smads信號通路系統(tǒng)是由TGF-β家族及其受體和Smads蛋白家族組成。在TGF-β家族中TGF-β1是強(qiáng)致纖因子，它可以趨化并誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞（CFs）分化成肌纖維細(xì)胞，后者具有平滑肌細(xì)胞和CFs雙重功能，能夠合成ECM并與TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子發(fā)生反應(yīng)，加速心肌纖維化的進(jìn)程。另外TGF-β1可以直接刺激膠原蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）等

4、因子的表達(dá)，從而促進(jìn)ECM的合成并且抑制其降解，進(jìn)而導(dǎo)致 ECM過度沉積，促使心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。以TGF-β、Smads蛋白為靶點(diǎn)，阻斷TGF-β1/Smads信號通路來進(jìn)行抗心肌纖維化治療的研究已成為熱點(diǎn)，并取得了一定成績，但由于TGF-β1/Smads信號通路與多條信號通路存在交叉作用，使得抗TGF-β1/Smads信號通路藥物的臨床療效并不確切，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TSNⅡA）是從丹參

5、中提取的脂溶性活性單體，因其具有抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗血小板聚集、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等作用而在臨床中被廣泛用來治療冠心病、心律失常等心血管疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TSNⅡA能夠通過減少ECM合成,抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，達(dá)到抗纖維化的作用，但TSNⅡA抗纖維化作用究竟如何，以及其抗纖維化作用機(jī)制是否是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路來實(shí)現(xiàn)的，仍需進(jìn)一步研究。
　　目的：通過皮下植入植入式滲透給藥壓力泵緩釋 An

6、gⅡ的方法構(gòu)建大鼠心臟纖維化模型，給予不同劑量TSNⅡA進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠心臟纖維化情況和TGF-β1/Smads信號通路中TGF-β1、p-Smad2/3蛋白及其下游因子CTGF、PAI-1 mRNA和蛋白質(zhì)水平變化的情況，研究TSNⅡA對AngⅡ所致大鼠心肌纖維化有無拮抗作用；并初步探討TSNⅡA抗纖維化作用是否與下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路活性相關(guān)，為TSNⅡA抗心肌纖維化的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用皮下

7、植入植入式滲透給藥壓力泵緩釋 AngⅡ的方法建立大鼠心臟纖維化模型。健康SD大鼠32只，體重150~200g，隨機(jī)取24只制造模型，余8只假手術(shù)對照。術(shù)后大鼠全部存活，將造模大鼠隨機(jī)分三組：模型組，給予生理鹽水70mg/（kg·d）灌胃；TSNⅡA低劑量組，給予35mg/（kg·d）TSNⅡ A灌胃；和TSNⅡA高劑量組，給予70mg/（kg·d）TSNⅡA灌胃（每組8只）；對照組給予生理鹽水70mg/（kg·d）灌胃。持續(xù)灌胃6周后，

8、測體重、心率、尾量法檢測各組大鼠尾動(dòng)脈壓。頸椎脫臼法處死大鼠，測左心室質(zhì)量（left ventricular weight，LVW），并計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）；取部分左心室行病理切片Masson染色觀察心臟纖維化情況；其余部分于液氮中保存，留做以下實(shí)驗(yàn)：化學(xué)比色法測定大鼠心肌組織內(nèi)羥脯氨酸（HYP）含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測CTGF和PAI-1mRNA表達(dá)

9、水平；Western-blot檢測CTGF、PAI-1、TGF-β1和胞內(nèi)信號蛋白p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴大鼠皮下植入植入式滲透給藥壓力泵緩釋AngⅡ2周，灌胃給藥持續(xù)6周,體重、心率的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而血壓、LVW、LVMI增加，給予TSNⅡA干預(yù)后，大鼠血壓變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而LVW、LVMI較模型組降低，并且高劑量TSNⅡA組LVW、LVMI低于低劑量TSNⅡA組。⑵模型組大鼠心肌組織內(nèi)HYP含量高

10、于對照組，大鼠心臟切片行Masson染色后顯示模型組大鼠心肌纖維化明顯，給予 TSNⅡA干預(yù)后，心肌組織內(nèi)HYP含量較模型組降低，大鼠纖維化程度較模型組減輕，并且高劑量TSNⅡA組心肌組織內(nèi)HYP含量低于低劑量TSNⅡA組，心肌纖維化程度較TSNⅡA低劑量組減輕。⑶RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠心臟組織中PAI-1、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平均較對照組

11、增高，給予TSNⅡA干預(yù)后，大鼠心臟組織中PAI-1、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平較模型組降低，并且TSNⅡA高劑量組大鼠心臟組織中PAI-1、CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平和TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平低于TSNⅡA低劑量組。
　　結(jié)論：①通過皮下植入植入式滲透給藥壓力泵緩釋 AngⅡ的方法能夠成功制造大鼠心肌纖維化模型，并伴隨著血壓的升高。②緩釋AngⅡ模