丹參酮ⅡA對(duì)大鼠肺間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IdiopathicPulmonaryFibrosis，IPF)是一種慢性、進(jìn)展性、致死性，自診斷后中位生存時(shí)間少于3年的疾病，已成為呼吸系統(tǒng)疾病中嚴(yán)重威脅人民健康的重大疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，尚無(wú)有效治療方法。近十年來(lái)，有關(guān)IPF的臨床試驗(yàn)活動(dòng)呈指數(shù)增長(zhǎng)，眾多學(xué)者對(duì)此病的重視，解決之迫切可見(jiàn)一斑。IPF不僅在發(fā)生環(huán)節(jié)其病因譜極為廣泛和復(fù)雜，同時(shí)在進(jìn)展過(guò)程中存在多個(gè)病理生理過(guò)程參與、多個(gè)信號(hào)通路活化，是免疫紊

2、亂、炎癥、纖維化的交織和不斷進(jìn)展的過(guò)程。近年來(lái)，大多數(shù)學(xué)者把多種原因引起的肺臟損傷作為研究IPF的出發(fā)點(diǎn)，同時(shí)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用組織病理學(xué)及多種檢測(cè)技術(shù)觀察到在IPF病變的初期，是以下呼吸道急性炎癥反應(yīng)為主，包括中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，分泌多種具有生物活性的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素（IL-1β和IL-6）等，同時(shí)又可刺激產(chǎn)生眾多氧化產(chǎn)物，最終導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)的紊亂，肺實(shí)質(zhì)損傷，膠原纖維成分在間質(zhì)

3、內(nèi)聚集及慢性增生，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。
　　近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)也表明氧化應(yīng)激（氧化/抗氧化失衡）與特發(fā)性肺纖維化的形成和發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，同時(shí)肺臟在解剖學(xué)上的結(jié)構(gòu)位置及其主要的生理功能決定了肺是最易受到氧化應(yīng)激攻擊的靶器官之一。氧化應(yīng)激(OxidativeStress)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，氧化作用占優(yōu)勢(shì)，可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)，分泌蛋白酶增加，產(chǎn)生許多的氧化中間產(chǎn)物，造成氧化損傷。正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在著抗氧化系統(tǒng)，

4、如酶系的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等，這些抗氧化酶能對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基作出迅速及時(shí)地調(diào)節(jié)，能把過(guò)多生成的自由基清除，以保證體內(nèi)氧化/抗氧化作用平衡，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。但如果在一些不明原因的刺激因素下，體內(nèi)有超過(guò)清除能力的氧自由基生成，或者機(jī)體抗氧化能力下降，體內(nèi)SOD和GSH-Px的活性降低，就會(huì)致使相應(yīng)組織細(xì)胞的損傷，對(duì)肺臟而言，就會(huì)引起肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及肺臟間質(zhì)細(xì)胞等的損傷，引起這些細(xì)胞膜的脂

5、質(zhì)成分發(fā)生過(guò)氧化作用。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也常用檢測(cè)氧化應(yīng)激過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成量來(lái)判斷體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用的程度，許多研究在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)炎性刺激后動(dòng)物體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的生成量增加也佐證了這一觀點(diǎn)，同時(shí)因自由基過(guò)多可損傷組織或細(xì)胞導(dǎo)致MDA的生成，是自由基生成情況的一個(gè)間接反映。同時(shí)，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡的另一種生物標(biāo)記物——髓過(guò)氧化物酶(MPO)，其水平也經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在IPF患者的BALF中有明顯地升

6、高。同時(shí)，在肺纖維化復(fù)雜病變的發(fā)生發(fā)展中，多種不明原因的刺激可使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)的活性被誘導(dǎo)，導(dǎo)致其合成的一氧化氮(NO)濃度較組成型NOS(constitutiveNOS，cNOS)的濃度明顯增高，可引起NO的產(chǎn)生增多。同時(shí)，在纖維化病變發(fā)展過(guò)程中，異常增多的炎性介質(zhì)可使體內(nèi)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的活性增強(qiáng)，產(chǎn)生前列腺素(pr

7、ostaglandin，PG)，尤其是PGE2增多，進(jìn)而也會(huì)導(dǎo)致炎癥損傷，引起炎性循環(huán)。因此現(xiàn)使用抗氧化劑治療特發(fā)性肺纖維化也正在逐漸受到眾多專家和學(xué)者的重視和認(rèn)同。
　　近年來(lái)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用備受肯定，TGF-β1可以促進(jìn)成-肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，而循環(huán)或肺組織中的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化也是現(xiàn)階段肺間質(zhì)纖維化發(fā)病

8、機(jī)制中的研究熱點(diǎn)，已被眾多的學(xué)者認(rèn)為是IPF發(fā)展過(guò)程中的重要病理過(guò)程，這種表型轉(zhuǎn)化在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物組織病理學(xué)檢測(cè)中都已被觀察到。同時(shí)TGF-β1也可刺激許多種細(xì)胞及炎癥因子的合成、分泌，引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其作用的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)先與受體結(jié)合，而后主要通過(guò)下游的Smad2/3轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成的，而我們之前課題研究也已證實(shí)TGF-β1受體的Ⅰ型受體中的活化素受體樣激酶5(activinreceptorlikekinase5，ALK5)在肺間質(zhì)纖維化

9、過(guò)程中有明顯升高，這提示ALK5參與了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)展。
　　醫(yī)學(xué)界關(guān)于IPF治療方法的研究一刻都沒(méi)有停止過(guò)，多年來(lái)，對(duì)于其治療方法經(jīng)歷了不同方向的探索，但由于IPF是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的疾病，無(wú)法從根源著手去阻抑其發(fā)生發(fā)展，也無(wú)特效治療方法。2011年IPF的診治指南有了不同于2000年ATS/ERS共識(shí)的新意見(jiàn)，其將大多數(shù)治療措施改為不同強(qiáng)度的推薦意見(jiàn)，僅N-乙酰半胱氨酸、吡菲尼酮、抗凝藥物等少數(shù)藥物獲得“弱推薦

10、”，主要因?yàn)樗鼈冇休^好的安全性，同時(shí)少部分患者用藥治療后有部分療效。而糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑等藥物因其對(duì)機(jī)體有較大的不良作用，在臨床上的應(yīng)用有很大的局限性，因此，開(kāi)發(fā)有效的藥物以控制肺間質(zhì)纖維化的病情，對(duì)于提高患者生活質(zhì)量或降低患者死亡率具有重要意義?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)多種中藥單體成分均有不同程度抑制肺纖維化的作用。丹參作為一種經(jīng)典傳統(tǒng)中藥，多年來(lái)被廣泛應(yīng)用于心血管病的治療中，而丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是從丹參中提取出的

11、脂溶性成分之一，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥單體中研究較多的活性成分，其在丹參酮中含量最高，也是最為穩(wěn)定的有效活性成分，其具有明確的分子結(jié)構(gòu)，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參酮ⅡA不僅具有清除氧自由基和抗炎的作用，且還具有抗腫瘤等多種藥學(xué)活性。同時(shí)，丹參酮ⅡA還具有多種肺保護(hù)作用。Wang等人的研究表明丹參酮ⅡA可以減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化。然而，目前關(guān)于丹參酮ⅡA如何作用于肺間質(zhì)纖維化，其相關(guān)的具體生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚。
　　本課題擬采用氣

12、管內(nèi)滴注博萊霉素的方法建立大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，探討丹參酮ⅡA對(duì)大鼠肺間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及對(duì)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響，并進(jìn)一步探討其對(duì)肺間質(zhì)纖維化相關(guān)分子作用機(jī)制的影響。
　　第一部分
　　丹參酮ⅡA對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠組織形態(tài)學(xué)變化的影響
　　目的:探討丹參酮ⅡA對(duì)大鼠肺纖維化組織形態(tài)學(xué)變化的影響，以明確丹參酮ⅡA對(duì)肺間質(zhì)纖維化有無(wú)保護(hù)作用。
　　方法:清潔級(jí)SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機(jī)數(shù)

13、字表法分為正常對(duì)照組（N組），丹參酮ⅡA組，纖維化組（模型組），丹參酮ⅡA+纖維化組，每組6只。各組干預(yù)28天，然后收集各組肺泡灌洗液后，處死所有大鼠，取肺組織，對(duì)肺組織進(jìn)行石蠟包埋后行組織病理學(xué)檢測(cè)，并計(jì)算肺組織的濕/干重比。
　　結(jié)果:經(jīng)丹參酮ⅡA干預(yù)性治療的丹參酮ⅡA+纖維化組大鼠的肺濕/干重比明顯低于纖維化模型組，病理組織學(xué)可見(jiàn)肺泡間隔纖維增生灶較少，累及病變范圍較小，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較少，膠原總含量減少。
　　結(jié)論:

14、丹參酮ⅡA能降低肺間質(zhì)纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的含量，減輕肺間質(zhì)纖維化的程度，對(duì)肺間質(zhì)纖維化有一定的保護(hù)作用。
　　第二部分
　　丹參酮ⅡA對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響
　　目的:觀察丹參酮ⅡA對(duì)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)一步探討丹參酮ⅡA改善肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（N組），丹參酮ⅡA組，纖維化組（模型組），丹

15、參酮ⅡA+纖維化組，每組6只。各組干預(yù)28天，收集各組大鼠肺泡灌洗液后處死，取肺組織，通過(guò)檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量、總細(xì)胞數(shù)，對(duì)中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察，ELISA檢測(cè)各組大鼠BALF中相關(guān)炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，來(lái)探討丹參酮ⅡA對(duì)肺炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子的影響，通過(guò)試劑盒方法檢測(cè)各組大鼠肺組織中的MDA含量、MPO的活性及NO和PGE2含量，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及westernblot技術(shù)檢測(cè)各

16、組大鼠肺組織中iNOS和COX-2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:經(jīng)博萊霉素干預(yù)28d后，纖維化模型組大鼠BALF中的總蛋白含量、總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也顯著增加，肺組織內(nèi)MDA的含量和MPO的活性較正常對(duì)照組明顯增加或增強(qiáng)，同時(shí)也伴隨有NO的過(guò)量產(chǎn)生和PGE2的增多。免疫印跡結(jié)果和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在蛋白水平和mRNA水平上，iNOS和COX-2的表達(dá)量也是

17、較正常對(duì)照組顯著增加的。但在丹參酮ⅡA干預(yù)性治療組，上述炎癥細(xì)胞和炎癥因子及產(chǎn)物明顯降低或減少，這進(jìn)一步解釋了丹參酮ⅡA對(duì)肺間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用機(jī)制。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA可通過(guò)降低肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中的炎癥細(xì)胞和炎癥反應(yīng)因子，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低iNOS和COX-2的表達(dá)，使肺纖維化緩解或減輕。
　　第三部分
　　丹參酮ⅡA對(duì)肺間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1/ALK5/Smad2/3傳導(dǎo)通路的影響
　　目的:進(jìn)一步

18、探討丹參酮ⅡA的保護(hù)作用是否與其抑制TGF-β1/ALK5/smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的某個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，為丹參酮ⅡA應(yīng)用于治療肺間質(zhì)纖維化提供更多的理論基礎(chǔ)。
　　方法:清潔級(jí)SD大鼠，體重200-220g，雌雄不限，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（N組），丹參酮ⅡA組，纖維化組（模型組），丹參酮ⅡA+纖維化組，每組6只。各組干預(yù)28天，然后收集各組肺泡灌洗液后，處死所有大鼠，取肺組織，結(jié)合前期組織病理改變，應(yīng)用ELISA，免疫印跡技術(shù)

19、檢測(cè)TGF-β1、ALK5和Smad2/3的表達(dá)。
　　結(jié)果:在氣管內(nèi)滴注博萊霉素造模28d后，纖維化模型組大鼠血清及組織中的TGF-β1、ALK5及Smad2/3明顯增加，與正常對(duì)照組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在應(yīng)用丹參酮ⅡA干預(yù)性治療后，大鼠血清TGF-β1水平下降顯著，同時(shí)ALK5及Smad2/3表達(dá)量也明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA可以抑制博萊霉素致