丹參酮保護(hù)海水淹溺性肺損傷的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　丹參是唇形科植物，其根莖經(jīng)人工干燥后可制成傳統(tǒng)中藥材，廣泛應(yīng)用于各種心腦血管疾病的臨床治療。目前已在丹參中檢驗出多種水溶性或脂溶性化合物，這些活性成分不但具有擴(kuò)張冠狀動脈、改善心肌供血、血改善微循環(huán)，還有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種藥理作用。丹參酮(tanshinoneTan)是丹參(salivamitiorrhizabge)根莖中提取的一類的脂溶性成分，均含有鄰醌或?qū)︴Y(jié)構(gòu)，故總稱丹參酮類化合物。其中尤其以丹參酮經(jīng)磺化

2、而形成的水溶性衍生物——丹參酮ⅡA磺酸鈉（TIIA），表現(xiàn)出更多種生物活性，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于心腦血管疾病的臨床治療，經(jīng)大量的實驗證實TIIA還具有較強(qiáng)的抗腫瘤，抗炎及抗氧化等藥理作用。有研究報道，TⅡA對LPS誘導(dǎo)動物的肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制包括通過抑制NF-KB的活化，降低磷脂酶A2(PLA2)的活性，減少一氧化氮等炎癥因子而減輕肺損傷時的組織炎癥；并且通過對抗細(xì)胞氧化和細(xì)胞凋亡，緩解肺組織細(xì)胞損傷而改善微血管的通透性等，然而Tan

3、ⅡA對淹溺肺損傷的作用和機(jī)制尚未見報道。
　　海水淹溺肺水腫(PE2SWD)主要表現(xiàn)為低氧血癥和肺水腫，其損傷機(jī)制包括嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致的肺功能異常，海水對肺泡上皮細(xì)胞的表面活性物質(zhì)的破壞，海水導(dǎo)致炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的聚集后溶解酶和氧自由基過度釋放，海水導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷、水通道和離子通道改變、內(nèi)皮素、降鈣素和血紅素氧合酶的改變。目前臨床上仍缺乏理想的治療措施。前期的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松可以通過抑制炎癥而起

4、到防治PE2SWD的作用，TanⅡA也可通過抑制炎癥保護(hù)LPS誘導(dǎo)的肺損傷，然而TIIA在淹溺肺損傷的效應(yīng)仍未見報道。
　　因此本實驗在大體及細(xì)胞實驗中采用細(xì)胞免疫及分子生物學(xué)等多項技術(shù)，揭示淹溺肺損傷的炎癥機(jī)制,探討TIIA對淹溺肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　目的：
　　1.建立大鼠海水淹溺性肺損傷模型；
　　2.探討海水淹溺性肺損傷的炎癥機(jī)制；
　　3.揭示TIIA保護(hù)海水淹溺性肺損傷的機(jī)制。
　

5、　方法：
　　1.本實驗通過向氣管內(nèi)插管的大鼠肺內(nèi)吸入適量海水，成功復(fù)制出符合海水淹溺的實際情況又符合ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)的SWD一ALI動物模型.
　　2.24只大鼠分為正常對照組、海水淹溺組、丹參酮干預(yù)組及丹參酮對照組。淹溺組大鼠氣管內(nèi)注入4ml/kg海水，丹參酮組大鼠在造模后30分鐘腹腔內(nèi)注入TIIA（25mg/kg），，于不同時間點檢測PaO2的變化,通過檢測ＨＥ染色改變觀察肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，檢測肺組織濕干比的變化觀察肺組

6、織水腫，通過檢測MPO活性驗證肺組織炎癥細(xì)胞的浸潤，并用Western-blot法和ELISA法分別檢測MIF在肺組織和血漿中的表達(dá)。
　　3.實驗(一)NR8383細(xì)胞分為正常對照組，海水淹溺組，海水+ISO-1對照組，海水+TIIA干預(yù)組及TIIA對照組。海水淹溺組細(xì)胞上清中加入25％的海水，海水+TIIA干預(yù)組細(xì)胞上清液中加入10ug/mlTIIA,海水+ISO-1組細(xì)胞上清中加入ISO-1（50uM）。取4小時時間點通過E

7、LISA法檢測細(xì)胞上清中MIF，IL-6與TNF-α的表達(dá)。Western-blot法檢測phospho-NF-κBp65的表達(dá)。
　　實驗(二)NR8383細(xì)胞分為正常對照組，rMIF干預(yù)組，TIIA干預(yù)組。rMIF干預(yù)組細(xì)胞上清中加入rMIF(25ug/ml)，TIIA干預(yù)組細(xì)胞上清中加入MIF(25ug/ml)后加入TIIA（10ug/ml），取4小時時間點通過ELISA法檢測細(xì)胞上清中MIF，IL-6與TNF-α的表達(dá)。W

8、estern-blot法檢測phospho-NF-κBp65的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．海水性淹溺肺損傷模型復(fù)制成功。
　　2.相對于正常對照組，海水淹溺組大鼠出現(xiàn)肺水腫，低氧血癥，并伴有肺組織損傷及炎癥細(xì)胞的聚集，同時肺組織內(nèi)MIF高表達(dá)，MPO活性隨之增高。丹參酮干預(yù)后肺損傷減輕，MIF的高表達(dá)受到抑制，并伴有MPO活性降低。
　　3.實驗(一)海水淹溺組細(xì)胞MIF分泌增加，phospho-NF-κBp65

9、及IL-6和TNF-α的表達(dá)也相應(yīng)增加。ISO-1干預(yù)組中MIF表達(dá)正常但活性受到抑制，phospho-NF-κBp65及IL-6和TNF-α的表達(dá)相對于海水淹溺組明顯減少，海水+TIIA干預(yù)組中細(xì)胞MIF分泌減少，phospho-NF-κBp65及IL-6和TNF-α的表達(dá)減少。TIIA對照組組中各細(xì)胞因子的表達(dá)相對于正常對照組無明顯變化。
　　實驗(二)rMIF干預(yù)組細(xì)胞上清中phospho-NF-κBp65及IL-6和TNF