NFAT5在海水淹溺性肺損傷中作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　海水淹溺是航海作業(yè)環(huán)境常見(jiàn)的意外事故,也是軍隊(duì)海上作戰(zhàn)戰(zhàn)斗減員的主要原因之一。人體吸入海水后,引起肺順應(yīng)性改變、海水淹溺型肺水腫、肺內(nèi)分流、低氧血癥及酸中毒,若不及時(shí)處理可導(dǎo)致全身臟器不可逆的損害。其中海水淹溺后造成的肺水腫(pulmonary edema induced by seawater drowning,PE-SWD)和炎癥,經(jīng)過(guò)海水淹溺型急性肺損傷(seawater aspiration induced

2、 acute lung injury,SWD-ALI)階段進(jìn)一步發(fā)展為海水淹溺型急性呼吸窘迫綜合征(seawater aspiration induced acute respiratory distress syndrome,SWD-ARDS),救治起來(lái)極為困難,病死率極高。有研究報(bào)道,NFAT5是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一已知的滲透壓轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子,高滲可以導(dǎo)致細(xì)胞皺縮,線粒體去極化,DNA損傷,最終造成細(xì)胞凋亡,NFAT5則是負(fù)責(zé)在這種條件下

3、維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。最近研究表明,NFAT5通過(guò)刺激前炎因子的表達(dá),在炎癥疾病中扮演著重要的角色?，F(xiàn)廣泛報(bào)道的海水淹溺型肺損傷的發(fā)病機(jī)制并不完善,治療也具有一定的限制性,效果并不十分理想。因此,正確認(rèn)識(shí)海水淹溺導(dǎo)致肺損傷的機(jī)理是及時(shí)有效治療海水吸入所致急性肺損傷的基礎(chǔ),對(duì)海水淹溺型肺損傷發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究具有十分重要的臨床指導(dǎo)意義。本課題結(jié)合海水本身的高滲特征和肺損傷發(fā)病的普遍機(jī)理,致力于找到海水這一特殊液體引起急性肺損傷的具體

4、發(fā)病機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本實(shí)驗(yàn)研究了NFAT5在海水淹溺型肺損傷中所扮演的重要角色,通過(guò)復(fù)制SWD-ALI大鼠模型,觀察NFAT5及有機(jī)滲透物質(zhì)在海水淹溺發(fā)生后表達(dá)的變化,以及其對(duì)山梨醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,醛糖還原酶等有機(jī)滲透物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控,探討NFAT5在海水淹溺型肺損傷發(fā)生后對(duì)肺水腫的減輕機(jī)制。并探索NFAT5在海水淹溺發(fā)生后炎癥環(huán)節(jié)中,所扮演的重要角色。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):

5、r>　　復(fù)制SD大鼠海水淹溺肺損傷模型,將56只180-200gSD大鼠隨機(jī)分為7組,對(duì)照組,海水淹溺1h組,2h組,3h組,4h組,5h組,6h組,每組8只。按1ml/kg給予大鼠3％戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后,經(jīng)氣管注入新鮮配制海水(4ml/kg)。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的選擇,處死動(dòng)物后,取左下肺組織行HE染色,觀察病理變化。右下肺組織稱重,烘干,進(jìn)行濕/干比值的檢測(cè)。大鼠處死后的肺組織分塊并保存于-80°C冰箱,分別用于ELISA檢測(cè)炎癥因子

6、變化,Western Blot、免疫組化檢測(cè)NFAT5蛋白含量變化,實(shí)時(shí)定量PCR在mRNA水平檢測(cè)NFAT5及滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化,有機(jī)滲透物質(zhì)如山梨醇、?；撬?、甜菜堿變化,由液相質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)。
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　A549細(xì)胞的培養(yǎng)及處理:使用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞,在進(jìn)行海水干預(yù)前行MTT試驗(yàn),向培養(yǎng)液中加入不同比例海水,觀察不同濃度海水對(duì)細(xì)胞的抑制率,選擇合適濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)觀察不同滲透

7、壓對(duì)A549細(xì)胞的影響:選擇20%,30%,40%,50%濃度梯度海水干預(yù)細(xì)胞,培養(yǎng)6h,行Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR觀察細(xì)胞NFAT5在蛋白及mRNA水平的變化。(2)觀察不同海水干預(yù)時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞的影響:選擇30%濃度海水,分為4h,6h,8h,10h,12h組,行WesternBlot及實(shí)時(shí)定量PCR觀察細(xì)胞NFAT5在蛋白及mRNA水平的變化。(3)ELISA檢測(cè)不同滲透壓及時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后IL-6

8、,IL-1β,TNF-α在細(xì)胞上清液中的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　大鼠注入海水后,肺組織W/D,ELI較對(duì)照組顯著增加(p<0.01),高滲刺激后滲透壓保護(hù)基因NFAT5蛋白及mRNA表達(dá)量增加,同時(shí),有機(jī)滲透物質(zhì)和滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量也隨NFAT5的增加而增加。隨時(shí)間的變化,肺水腫程度減輕。根據(jù)ELISA,HE染色,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果,發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在4h時(shí)開(kāi)始加重。
　　體外實(shí)驗(yàn):
　

9、　通過(guò)Westernblot和qRT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)隨滲透壓的升高及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),NFAT5及滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量均增加。ELISA結(jié)果顯示,隨NFAT5的升高,IL-6,IL-1β,TNF-α前炎因子的生成量增多。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　NFAT5在海水淹溺型肺損傷的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,在肺水腫發(fā)生過(guò)程中,NFAT5通過(guò)對(duì)SMIT、BGT1、AR等滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控,致使山梨醇,牛磺酸,甜菜堿等有機(jī)滲透物