蛋白酶激活受體-2在海水吸入大鼠急性肺損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的： 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺損傷(SW-ALI)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致海水型急性呼吸窘迫綜合征(SW-ARDS)，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。由于炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，人們將對(duì)ALI的研究轉(zhuǎn)向炎癥調(diào)控機(jī)制的研究，以期控制炎癥反應(yīng)，減輕損傷，從而降低ALI的發(fā)病率和死亡率。蛋白酶激活受體-2(PAR2)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，激活后可參與炎癥反應(yīng)，但在肺部炎癥反應(yīng)中的致病作用還存在爭(zhēng)議，在SW-AIL中的作用尚未提及，

2、且PAR2激活后下游信號(hào)通路仍不清楚，有待進(jìn)一步探討。FUT-175作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制PAR2的激活，減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及，有待進(jìn)一步研究。為此，本課題擬從細(xì)胞水平檢測(cè)海水對(duì)A549細(xì)胞PAR2表達(dá)的影響，從分子水平探討PAR2激活后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及FUT-175和PAR2抗體對(duì)其下游信號(hào)通路的干預(yù)作用，從器官水平觀察FUT-175對(duì)SW-ALI大鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺微血

3、管通透性的影響，旨在明確PAR2在SW-ALI中的作用及機(jī)制，從抗炎的角度揭示FUT-175對(duì)SW-ALI大鼠的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用FUT-175治療SW-ALI提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.將培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、海水干預(yù)2、4、8、16h組，各組細(xì)胞干預(yù)相應(yīng)的時(shí)間后進(jìn)行指標(biāo)觀測(cè)。收集上清檢測(cè)TNF-α和IL-8濃度，收集細(xì)胞用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和West

4、ern blot法檢測(cè)PAR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。 2.將培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)、海水干預(yù)組(seawater組)、海水+PAR2抗體組(PAR2-antibody組)、海水+FUT-175組(FUT-175組)、海水+SB203580組(SB203580組)、海水+PD98059組(PD98059組)、海水+SP600125組(SP600125組)。對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)液，海

5、水組加入海水培養(yǎng)8h；PAR2-antibody組用PAR2單克隆抗體2mg/L預(yù)處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；FUT-175組用FUT-17510μM預(yù)處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；SB203580組用SB20358010μM預(yù)處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；PD98059組用PD9805910μM預(yù)處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h；SP600125組用SP6001250μM預(yù)處理1h后，加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h。control

6、組、seawater組、PAR2-antibody組和FUT-175組收集細(xì)胞用Western印跡法和EMSA法分別檢測(cè)磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)量、磷酸化ERK蛋白表達(dá)量、磷酸化JNK蛋白表達(dá)量和NF-κB活化水平；各組細(xì)胞收集上清檢測(cè)TNF-α和IL-8濃度。 3.采用海水吸入法復(fù)制大鼠ALI模型，吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALl模型。將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、海水吸入2、4、8h組，取肺組織用實(shí)時(shí)熒

7、光定量PCR法檢測(cè)PAR2 mRNA表達(dá)水平，用Western blot法和免疫組化法檢測(cè)PAR2蛋白表達(dá)情況。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法復(fù)制大鼠ALI模型，96只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、海水組(seawater組)、LPS組(LPS組)和FUT-175治療海水吸入組(FUT-175組)。海水組和LPS組分別吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALl模型。seawater組：模型

8、復(fù)制成功后20min，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水2ml/kg。FUT-175組：海水型ALI模型復(fù)制成功后20min，經(jīng)尾靜脈注射FUT-17510mg/kg。4組大鼠觀察8小時(shí)，分別于模型建立及干預(yù)后0.5、1、2、4、8h進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，最后檢測(cè)肺微血管通透性(PMVP)、肺濕/干重比(W/D)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)、血漿IL-8和TNF-α水平，并觀察病理學(xué)變化。 結(jié)果： 1.與正常對(duì)照組比較，海水處理后，A5

9、49細(xì)胞PAR2 mRNA在4h時(shí)顯著升高(P<0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在8h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的1.8倍)，此后一直顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。A549細(xì)胞PAR2蛋白表達(dá)量也在4h時(shí)顯著升高(P<0.05)，在8h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的2.2倍)，此后一直顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。A549細(xì)胞經(jīng)海水處理后，上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高，2 h達(dá)最高峰，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。此后有所下降，但在所有時(shí)間

10、點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。 2.與正常對(duì)照組比較，海水處理后，A549細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平顯著升高(分別為對(duì)照組的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P<0.01-0.05)，NF-κB活化水平顯著升高(為對(duì)照組的6.7倍)(P<0.01)，而FUT-175和PAR2抗體預(yù)處理組同海水處理組比較，A549細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB

11、活化水平顯著降低(P<0.01-0.05)。海水處理后，A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α顯著升高(P<0.01)，而FUT-175、PAR2抗體、SB203580、PD98059和SP600125預(yù)處理組同海水處理組比較，上清液中IL-8和TNF-α則顯著降低(P<0.01)。 3.與正常對(duì)照組比較，海水吸入后，大鼠肺組織PAR2 mRNA和蛋白表達(dá)量在2h時(shí)即顯著升高(P<0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在4h點(diǎn)達(dá)最高峰

12、(為對(duì)照組的2.8倍)，此后均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。同時(shí)大鼠肺組織PAR2蛋白表達(dá)量在2h時(shí)即顯著升高(P<0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在4h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的4.2倍)，此后均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。PAR2免疫組化顯示，在正常對(duì)照組，PAR2微弱表達(dá)于肺泡、支氣管上皮和肺泡巨噬細(xì)胞，海水吸入2h后，陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，不僅見于肺泡和支氣管上皮細(xì)胞，還見于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞。 4.與正常對(duì)照組比

13、較，海水和LPS吸入致傷組大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺組織MPO活性增高、血漿IL-8和TNF-α升高、肺組織病理形態(tài)學(xué)積分增加(P<0.01)；海水組PaO2明顯低于LPS組，而MPO、W/D和PVMP明顯高于LPS組(P<0.01)。FUT-175治療海水吸入組上述指標(biāo)均顯著改善(P<0.01-0.05)。 結(jié)論： 1.海水處理A549細(xì)胞，可上調(diào)A549細(xì)胞PAR2的表達(dá)，導(dǎo)致IL-8和

14、TNF-α釋放的增加，同時(shí)可導(dǎo)致A549細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。 2.海水激活A(yù)549細(xì)胞PAR2后，通過MAPK信號(hào)通路和NF-B信號(hào)通路，導(dǎo)致IL-8和TNF-α釋放增加，是海水處理A549細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。 3.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175和PAR2抗體可通過抑制PAR2的激活，對(duì)海水處理的A549具有保護(hù)作用。 4.海水吸入后大鼠肺組織PAR2表達(dá)上調(diào)，在海水所致急性肺損傷中起重要作用。 5