Cypher和ENH在小鼠早期心臟發(fā)育中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、肌節(jié)的Z線是一個(gè)高密度的蛋白復(fù)合體。Z線具有維持肌細(xì)胞正常的骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和收縮功能的作用。在Z線中存在Cypher和Enigma homolog protein(ENH)兩種Enigma家族的亞型蛋白。ENH和Cypher高度同源，分別具有維持Z線結(jié)構(gòu)、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)和維持肌細(xì)胞正常收縮功能的重要作用。但Cypher和ENH同時(shí)變異或缺失后對于小鼠心臟發(fā)育過程有何影響目前未知。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Cypher和ENH

2、雙重敲除的小鼠模型。觀察Cypher和ENH被同時(shí)敲除后新生小鼠胚胎期心肌發(fā)育過程的變化情況。通過觀察小鼠心臟組織發(fā)育過程中的組織形態(tài)變化、病理特征、心肌細(xì)胞Z線結(jié)構(gòu)變化以及Z線結(jié)構(gòu)內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，為進(jìn)一步解釋上述兩種基因敲除后，小鼠模型心臟發(fā)育過程的變化機(jī)制提供證據(jù);同時(shí)也為研究人類相關(guān)基因變異所導(dǎo)致的疾病奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 基因敲除小鼠模型建立與鑒定:將一段含有ENH外顯子3的序列插入小鼠ENH基因

3、的第3個(gè)內(nèi)含子中，特異性的敲除小鼠的ENH基因。另外，將一段含β-galactosidase(LacZ)的序列插入小鼠Cypher基因的翻譯起始位點(diǎn)ATG之后，從而干擾小鼠Cypher基因的表達(dá)。通過兩條品系的小鼠雜交得到Cypher和ENH雙重敲除的小鼠。取成年小鼠尾尖組織或小鼠胚胎的新鮮胎膜，使用PCR技術(shù)篩選Cypher和ENH基因被敲除的小鼠。
　　 小鼠成活率觀察:分別取不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的小鼠胚胎，觀察不同基因型小鼠的存活

4、情況。
　　 小鼠胚胎心臟大體情況觀察:取新鮮小鼠胚胎進(jìn)行全胚對比并拍照。選擇不同基因型的小鼠胚胎制成石蠟組織塊后切片并進(jìn)行HE染色。使用顯微鏡下觀察小鼠胚胎心臟大體情況并拍照。
　　 小鼠胚胎心臟超微結(jié)構(gòu)觀察:取新鮮小鼠胚胎。固定后行超薄切片，使用透射電鏡觀察小鼠胚胎心肌的超微結(jié)構(gòu)并拍照。
　　 小鼠胚胎心臟內(nèi)蛋白表達(dá)水平和位置檢測:取新鮮小鼠胚胎。制成冷凍組織塊后切片或全胚固定，使用免疫染色技術(shù)和相關(guān)的特異性

5、抗體檢測小鼠胚胎或心臟切片內(nèi)的特異性蛋白表達(dá)和分布情況。然后使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察胚胎染色情況并拍照。取新鮮小鼠胚胎。急凍后收集蛋白，使用免疫蛋白印跡技術(shù)檢測小鼠胚胎內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。使用酵母雙雜交技術(shù)及鄰位連接技術(shù)檢測蛋白之間的相互作用。
　　 成年小鼠心臟內(nèi)特異性RNA量檢測:使用斑點(diǎn)分析技術(shù)對出生后6周成年小鼠心臟內(nèi)不同的RNA進(jìn)行檢測和半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 小鼠胚胎被雙重敲除Cy

6、pher和ENH后在心臟發(fā)育早期即出現(xiàn)心室壁變薄、心臟擴(kuò)大及死亡，同時(shí)有Z線結(jié)構(gòu)不完整及肌節(jié)成熟障礙。對小鼠胚胎心臟的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Z線內(nèi)α-Actinin和細(xì)肌絲排列結(jié)構(gòu)紊亂。Cypher與α-Actinin存在相互作用，Cypher的LIM結(jié)構(gòu)域還可以與Integrin的細(xì)胞膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生相互作用。但小鼠胚胎心肌Z線內(nèi)其它蛋白和粗肌絲的排列及表達(dá)情況未受Cypher和ENH缺失的影響。
　　 結(jié)論：
　　 Cypher和E

7、NH是兩個(gè)參與小鼠胚胎心臟發(fā)育的重要基因，并在小鼠胚胎心肌細(xì)胞的成熟過程中發(fā)揮相互補(bǔ)償?shù)淖饔?。單敲除Cypher或ENH都不會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死亡，而雙敲除Cypher和ENH則會(huì)引起小鼠胚胎早期(E10.5)死亡，并伴有一系列的胚胎與心臟發(fā)育異常，如胚胎發(fā)育延緩、心室腔擴(kuò)大及心室壁變薄。在小鼠胚胎心肌發(fā)育過程中，Cypher和ENH可能通過與α-Actinin的相互作用，在小鼠胚胎心肌細(xì)胞發(fā)育的過程中起到維持Z線和細(xì)肌絲成分正常組裝的作用